谷氨酰胺對甲氨蝶呤所致大鼠腸粘膜炎癥保護作用的研究.pdf

1、前言：
　　抗有絲分裂藥物甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)，通過阻斷DNA和RNA的合成，誘導細胞凋亡，并減緩或停止細胞增殖。由于其作用并非只針對腫瘤組織，還會誘發(fā)對快速增殖細胞，如骨髓和腸黏膜細胞的有害影響。在細胞毒性藥物治療后臨床表現(xiàn)出消化道毒性如粘膜炎，粘膜潰瘍融合可影響整個消化道，導致如吞咽困難，嘔吐，腹瀉，體重減輕，直腸出血和感染癥狀。目前沒有有效的規(guī)范治療方法，減少口腔和胃腸道的腸黏膜炎?；煂е履c毒性的分

2、子機制仍不明確。因此研究進步預防干預作用仍然是一個挑戰(zhàn)。
　　腸黏膜的機械屏障由連續(xù)的腸黏膜上皮細胞、其間的連接和黏膜的特殊結構以及腸表面黏液層組成。腸黏膜機械屏障的結構基礎是完整的腸上皮細胞和相鄰腸上皮細胞之間的連接，兩者共同構成腸道的選擇性屏障，并調控著水和溶質的跨上皮細胞轉運。細胞間的連接有緊密連接、黏附連接、縫隙連接和橋粒等，而緊密連接則是腸上皮細胞間主要的連接方式。
　　腸上皮還創(chuàng)建了免疫屏障調節(jié)管腔共生細菌與黏膜

3、免疫系統(tǒng)的相互作用。腸上皮細胞(intestinal epithelial cell，IEC)，尤其是小腸的潘氏細胞，產生和釋放抗菌因子減少細菌在腸上皮表面的定植的數(shù)量，調節(jié)腸道復雜的細菌的組成。為了其重要免疫調節(jié)功能，IEC需要檢測腸道細菌和調整他們的反應，旨在維持自身動態(tài)平衡。IEC表達幾種模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），包括Toll樣受體(Toll-like receptors

4、，TLRs)和NOD樣受體(Nod-like receptors, NLRs)，檢測到共生的細菌。觸發(fā)這些受體誘導激活核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)等促炎途徑產生抗菌因子，細胞因子，趨化因子和其他分子促進上皮細胞和腸黏膜免疫細胞之間聯(lián)系。
　　谷氨酰胺(glutamine，GLN)是血液中最豐富的氨基酸，它是主要的腸上皮細胞代謝前體。腸細胞很大程度上依賴于谷氨酰胺作為代謝前體，合成如核苷酸，氨基糖和蛋白

5、質。它是目前應用非常廣泛的腸黏膜保護劑，是維持腸道黏膜代謝、結構和功能的必須營養(yǎng)成分，對維護腸黏膜細胞的生長、分化和增殖具有重要的意義。本文通過研究MTX模型鼠小腸炎癥發(fā)生機制，了解谷氨酰胺是否與腸上皮細胞間緊密連接和NF-κ Bp65通路調節(jié)有關，進一步揭示MTX誘發(fā)的腸粘膜病理狀態(tài)分子機制，以及谷氨酰胺是否對其有保護作用。
　　實驗材料和方法
　　一、動物模型及分組
　　10-12周SD大鼠，體重250-300g，

6、由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供。隨機分為3組。每組16只。根據腹腔注射藥物的不同將SD大鼠分為3組:CON組(control group):腹腔注射生理鹽水1ml連續(xù)2天，每日口服灌胃生理鹽水1ml。
　　MTX組:腹腔注射MTX1 ml(20mg/kg)連續(xù)2天，每日口服灌胃生理鹽水1ml。
　　GLN組:腹腔注射MTX1 ml(20mg/kg)連續(xù)2天，每日口服灌胃GLN1ml(2g/kg·d)。
　　

7、二、實驗標本采集及處理
　　造模后每天觀察動物一般狀況、糞便情況及稱量體重;各組于注射MTX后第6，8天各隨機取8只鼠，10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉，留取腸標本后處死。
　　1、無菌操作下取回盲部末段回腸4cm，用冰鹽水灌注，清除小腸內容物，分別放入4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片;2.5％戊二醛中保存，行電鏡檢測。病理組織學觀察為盲法。取0.1g腸組織加1ml PBS充分剪碎后離心，留上清用于ELISA檢測

8、。
　　2、留取腸組織2cm，以無菌生理鹽水沖洗腸腔，濾紙吸干水分，消毒錫紙、紗布包裹，標記，放入液氮中速凍并轉-70℃深凍冰箱保存，用于Real time quantitiveRT-PCR及Western Blotting檢測。
　　三、試驗方法及檢測指標
　　1、動態(tài)觀察大鼠一般狀態(tài)、體重和排便情況。
　　2、病理形態(tài)學研究
　　(1)各組動物于各時間點處死后，剖開腹腔，觀察腸管顏色、有無水腫、出血、擴

9、張、透壁潰瘍及粘連。
　　(2)光鏡觀察:小腸組織常規(guī)固定后，H-E染色，光鏡下觀察小腸組織形態(tài)學改變。
　　(3)電鏡觀察:小腸組織固定后，常規(guī)作透射電鏡觀察小腸組織超微結構和腸絨毛的變化。
　　3、ELISA檢測腸組織白細胞介素IL-6，IL-23，IL-17含量。
　　4、免疫組化法測定ZO-1，Occludin，Claudin-1分布及表達。
　　5、實時定量PCR分析ZO-1，Occludin，C

10、laudin-1和NF-κBp65表達。
　　6、Western Blot法測定腸組織ZO-1，Occludin，Claudin-1和NF-κBp65蛋白表達。
　　四、統(tǒng)計學分析
　　計量資料結果以均值±標準差((X)±S)表示，差異比較用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用方差分析LSD法(Least significant difference)。P＜0.05提示有統(tǒng)計學意義。
　　實驗結果：

11、r>　　一、一般情況
　　MTX組大鼠在注射MTX后3天出現(xiàn)體毛凌亂，精神差，食欲下降，粘液便等癥狀，至第6天癥狀達到高峰，伴體重下降明顯平均下降8.2％，至第八天時體重逐漸恢復增加平均減少6.9％。GLN組大鼠出現(xiàn)上述癥狀時癥狀略輕，6天時體重平均減少6.2％。對照組大鼠活潑，進食好，體重增加明顯。
　　二、光鏡下病理變化觀察
　　對照組大鼠小腸組織，粘膜腺體排列整齊，隱窩表面上皮完整，粘膜固有層有少許淋巴細胞，無明

12、顯炎性細胞浸潤。光鏡下觀察MTX給藥后第6天可見廣泛粘膜下層中性粒細胞及其它炎性細胞浸潤水腫明顯。損傷部位四周粘膜腺體排列不齊或破壞，杯狀細胞減少甚至消失，腸壁水腫;損傷評分與對照組相比有差異（P＜0.05）。GLN組與MTX組粘膜比較損傷減輕(P＜0.05)，炎細胞浸潤減弱，水腫減輕。MTX造模后8天，與造模后6天相比粘膜損傷多為局部改變，非透壁性的，炎細胞浸潤程度減輕，水腫存在，杯狀細胞減少或消失，與對照組相比有顯著差異(P＜0.0

13、5)。GLN組與MTX組相比有顯著性差異（P＜0.05）。
　　三、腸組織在電鏡下變化
　　對照組腸黏膜上皮細胞表面微絨毛排列整齊，柱狀上皮細胞結構完整;細胞質內細胞器豐富，結構未見異常;細胞間連接緊密。MTX組微絨毛變細、稀疏、排列不整、呈倒伏狀，部分斷裂、脫落;高爾基復合體水腫擴張，內質網腫張，細胞連接增寬。6天時電鏡改變最明顯。GLN組6天回腸電鏡改變:腸上皮微絨毛局部缺損，排列不夠規(guī)則，細胞器未見明顯擴張。8天細胞損

14、傷有所恢復，細胞連接略增寬，異染色質邊集。
　　四、ELISA檢測腸組織白細胞介素IL-6，IL-23，IL-17
　　6天時MTX組經ELISA分析見IL-6，IL-23，IL-17表達明顯增強，MTX組表達明顯強于GLN組，差異均顯著（P＜0.05），較對照組表達明顯增加。8天時MTX組表達明顯強于GLN組，差異顯著(P＜0.05)。
　　五、腸組織ZO-1，Occludin和Claudin-1蛋白表達
　　

15、（一）免疫組化顯示
　　6天標本ZO-1，Claudin-1，Occludin于MTX組、GLN組蛋白表達減少，較對照組有差異(P＜0.05)，ZO-1，Occludin在GLN組蛋白表達較MTX組增多，差異顯著(P＜0.05)。8天標本ZO-1，Occludin，Claudin-1于MTX組蛋白表達減少較對照組有差異（P＜0.05），GLN組蛋白表達與MTX組差異顯著(P＜0.05)。
　?。ǘ￤estern Blot檢

16、測腸組織ZO-1，Occludin，Claudin-1和NF-Bp65蛋白表達
　　ZO-1，Occludin蛋白在第6天時對照組表達明顯增強，MTX組表達明顯弱于GLN組，差異均顯著(P＜0.05)。8天時ZO-1，Occludin，Claudin-1 MTX組和GLN組與對照組比較差異顯著(P＜0.05)，MTX組表達明顯弱于GLN組，差異顯著(P＜0.05)。
　　NF-κBp65蛋白在第6天，8天時經WestenBi

17、ot分析見MTX組表達明顯增多，GLN組表達明顯弱于MTX組，差異均顯著(P＜0.05)。MTX組和GLN組較對照組表達均增加(P＜0.05)。
　　六、腸組織ZO-1，Occludin，Claudin-1和NF-κB p65分子生物學顯示
　　GLN組、MTX組與對照組比較ZO-1，Occludin和Claudin-1的基因表達水平均有減低，兩組變化趨勢一致;基因水平在第6天減低明顯，到第8天有所恢復，較對照組有顯著差異（

18、P＜0.05）。在第8天GLN組的基因表達均較MTX組升高，差異顯著(P＜0.05)。
　　GLN組、MTX組與對照組比較NF-Bp65的基因表達水平均有明顯升高，兩組變化趨勢一致;基因水平在第6天升高明顯，到第8天有所恢復，較對照組有顯著差異（P＜0.05）。在第6天、8天MTX組的基因表達均較GLN組升高，差異顯著(P＜0.05)。
　　結論：
　　1、GLN能減輕MTX誘導的大鼠腸粘膜炎癥病理損傷，并能促進損傷的

19、修復。
　　2、針對由MTX誘導的大鼠腸炎模型口服GLN是一個方便而且有效的治療方法。
　　3、甲氨蝶呤誘導腸粘膜炎時，可以使緊密連接蛋白Occludin，Claudin-1，ZO-1表達下調。
　　4、應用谷氨酰胺對甲氨蝶呤誘導腸粘膜炎有保護作用機制之一可能與Occludin，Claudin-1，ZO-1表達有關。
　　5、甲氨蝶呤誘導腸粘膜炎時使NF-κBp65表達上調。
　　6、應用谷氨酰胺對甲氨蝶呤