益生菌對(duì)甲氨蝶呤所致黏膜損傷的干預(yù)研究.pdf

1、近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步，兒童腫瘤的生存率已由10％上升到80％，急性淋巴細(xì)胞白血病已由六個(gè)月中位生存期上升到80％治愈率。其臨床總結(jié)主要應(yīng)歸功于治療方案的改進(jìn)以及新藥的開發(fā)。大劑量甲氨喋呤（HDMTX）對(duì)髓外防治急性淋巴細(xì)胞白血病的有效性已達(dá)成共識(shí)。其不僅有效防治髓外白血病的發(fā)生，且大大提高了ALL患兒的無病生存率。與放療比較，HDMTX遠(yuǎn)期療效好，對(duì)患兒的智力和心理行為無不良影響，已經(jīng)成為現(xiàn)代兒童ALL髓外預(yù)防和全身化療的重要

2、組成部分。 然而MTX作為一種細(xì)胞周期特異性藥物，作用于S期細(xì)胞，除了殺滅增生旺盛的腫瘤細(xì)胞，對(duì)新陳代謝快的消化道粘膜、皮膚等部位的上皮細(xì)胞也較為敏感。短時(shí)間內(nèi)大劑量MTX進(jìn)入體內(nèi)，抑制腸上皮細(xì)胞增殖和上皮細(xì)胞功能，增加了感染及敗血癥的發(fā)生。文獻(xiàn)報(bào)道，正規(guī)化療后，黏膜炎的發(fā)生率達(dá)40％，大劑量化療后可高達(dá)76％。黏膜炎的發(fā)生，不僅增加了病人的痛苦及花費(fèi)，嚴(yán)重時(shí)影響了化療的進(jìn)度甚至增加了死亡率。近年來此類報(bào)道屢見不鮮。因此如何最大

3、程度減輕HDMTX引發(fā)黏膜炎的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，是目前急需解決的問題。 益生菌系一種對(duì)人體有益的細(xì)菌，主要包括乳桿菌類、雙歧桿菌類和革蘭氏陽性球菌三大類。作為人體腸道微生態(tài)的重要組成部分，參與了宿主的消化、營養(yǎng)、代謝及吸收，并廣泛應(yīng)用于治療各種消化系統(tǒng)疾病，如新生兒肺炎繼發(fā)的腹瀉、新生兒黃疸、腸易激綜合征等。目前研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能夠通過免疫排斥、免疫調(diào)節(jié)加強(qiáng)胃腸道防御功能，發(fā)揮抗炎癥的作用。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，小鼠潰瘍性結(jié)腸炎、

4、壞死性小腸結(jié)腸炎的早期應(yīng)用益生菌，可明顯降低炎癥性細(xì)胞因子α—腫瘤壞死因子（TNF—α）、白細(xì)胞介素—1β（IL一1β）的表達(dá)，從而對(duì)炎癥起到預(yù)防作用。另外，益生菌能夠增加腸道局部sIgA的分泌，增強(qiáng)免疫功能，維持腸道的粘膜屏障?；熕碌酿つぱ椎陌l(fā)生機(jī)制主要為核轉(zhuǎn)錄因子—κB（NF—κB）激活上調(diào)基因，產(chǎn)生多種前炎癥細(xì)胞因子，如TNF—α、IL—1β、IL—6等，誘導(dǎo)克隆原細(xì)胞死亡、凋亡和組織損傷。益生菌能否通過干預(yù)炎癥過程，增強(qiáng)局部

5、免疫屏障，減輕化療所致黏膜炎的發(fā)生，目前鮮有報(bào)道。為此我們以HDMTX誘導(dǎo)Wistar大鼠建立黏膜炎模型，檢測(cè)腸組織TNF—α、腸表面粘液中sIgA、細(xì)菌移位等，探討益生菌對(duì)HDMTX誘發(fā)黏膜炎的干預(yù)治療機(jī)制，以期為臨床防治提供理論依據(jù)。 研究方法： Wistar大鼠54只，體重120g—160g，雌雄不限，隨機(jī)分為3組，A組（n=18）為正常對(duì)照組，B組（n=18）為MTX損傷組，C組（n=18）為益生菌干預(yù)治療組。

6、B和C組均腹腔注射MTX1ml（100mg/kg）。 A組于d0腹腔注射生理鹽水1 ml，并于前2天（d—2）開始經(jīng)口喂食生理鹽水2ml，一天兩次，直至處死。 B組于d0腹腔注射MTX1ml，并于前2天（d—2）開始喂食生理鹽水2ml，一天兩次，直至處死。 C組于d0腹腔注射MTX1 ml，并于前2天（d—2）開始經(jīng)口喂食金雙歧一粒，（每粒加入生理鹽水中制成2ml混懸液，內(nèi)含長雙歧桿菌活菌≥0.5×107C

7、FU，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球活菌≥0.5×106CFU），一天兩次，直至處死。 三組分別于d1、d3、d5各處死6只大鼠，觀察以下指標(biāo)： 1.取空腸近端腸管，制備HE染色的常規(guī)病理切片，光鏡下觀察小腸組織形態(tài)學(xué)改變，并在100倍光鏡下于每張切片中檢測(cè)10個(gè)絨毛高度和10個(gè)隱窩深度。 2.用免疫組織化學(xué)方法觀察小腸絨毛中TNF—α的表達(dá)：操作按照說明書進(jìn)行，以細(xì)胞膜和（或）胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，每張切片

8、隨機(jī)選取不重疊的10個(gè)高倍鏡視野（400倍），應(yīng)用Image—Pro Plus6.0彩色圖像分析系統(tǒng)分別計(jì)算每高倍鏡視野TNF—α的平均吸光度值A(chǔ)，并以此代表TNF—α在腸組織的表達(dá)水平。 3.Elisa檢測(cè)腸粘膜SIgA的表達(dá)：取靠近回盲部腸管4 cm，縱向剖開，生理鹽水反復(fù)沖洗后，用載玻片輕刮粘膜表面粘液至Eppdeffer管中，然后加入0.01mol/L的PBS液0.5 m1，充分混勻，10000 r/min離心15 mi

9、n，取上清液—20℃保存待測(cè)。 4.腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌培養(yǎng)：無菌條件下摘除腸系膜淋巴結(jié)數(shù)個(gè)稱重，將其研磨后取100μl研磨液于血培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h，對(duì)培養(yǎng)皿中的細(xì)菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。 5.觀察各組大鼠的死亡情況。 研究結(jié)果： 1、大鼠小腸組織形態(tài)學(xué)改變以及絨毛高度和隱窩深度正常組大鼠小腸組織無任何病理學(xué)改變。損傷組注射MTX后即出現(xiàn)了小腸黏膜炎的表現(xiàn)，以第三天最嚴(yán)重，腸組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，絨毛變短變粗，部分脫落，

10、隱窩變淺，甚至消失，大量炎性細(xì)胞浸潤。第五天病理改變略減輕。益生菌治療組各時(shí)間段均減輕小腸病理改變。MTX損傷組絨毛高度、隱窩深度均明顯低于正常對(duì)照組，以第三天最低。益生菌治療組絨毛高度和隱窩深度均明顯高于MTX損傷組。 2、TNF—α的表達(dá)大鼠空腸組織中TNF—α主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞和固有層中。正常對(duì)照組上皮細(xì)胞呈中度著色。MTX損傷組第一天大鼠腸上皮細(xì)胞染色最強(qiáng)，第三天開始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞壞死及脫落，著色不均勻。益生菌治療組第

11、1天腸上皮細(xì)胞則保持了相對(duì)的完整性，染色較MTX損傷組明顯減輕，與損傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、腸粘膜表面SIgA的含量與正常對(duì)照組比較，MTX損傷組腸粘膜表面的SIgA的含量明顯降低，益生菌治療組SIgA分泌較損傷組明顯升高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、大鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌定量培養(yǎng)正常對(duì)照組大鼠腸系膜淋巴結(jié)中未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長，MTX損傷組大鼠腸系膜淋巴結(jié)培養(yǎng)在第一、三、五天均發(fā)現(xiàn)菌落，益生菌治療后細(xì)菌培養(yǎng)明顯減少

12、。 5、各組大鼠死亡情況：試驗(yàn)期間正常組大鼠沒有出現(xiàn)非正常死亡的情況，MTX損傷組大鼠因腹瀉等化療副反應(yīng)死亡7只，而C組大鼠只死亡1只，兩組大鼠死亡率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、HDMTX能夠誘發(fā)大鼠典型黏膜炎的病理改變，用藥后第一天即出現(xiàn)明顯損傷，第三天最重，表現(xiàn)為小腸絨毛變短變粗，上皮細(xì)胞脫落，炎性細(xì)胞浸潤。 2、益生菌主要是通過減少上皮細(xì)胞中腫瘤壞死因子的表達(dá)，增加SIgA的分泌，減少了細(xì)菌移