谷氨酰胺和益生菌聯合應用對大鼠燒傷后腸道的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　1.明確嚴重燒傷所引起的機體及腸道氧化應激和炎癥反應的相關機制及iNOS在其中發(fā)揮的作用;
　　2.探討谷氨酰胺和益生菌聯合應用治療燒傷引發(fā)的腸道損傷的藥效和機制;
　　3.闡明燒傷所誘發(fā)iNOS在腸道中高表達的原因及探討谷氨酰胺和益生菌聯合應用對iNOS表達的表觀遺傳學影響。
　　材料和方法：
　　一、燒傷模型的建立、干預措施及取材
　　1.雄性Wistar大鼠110只（8周齡，140g

2、-185g），由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。分組如下（根據實驗設計分成兩個大組）:①對照組;模型組;谷氨酰胺治療組;益生菌治療組;谷氨酰胺+益生菌治療組;②對照組;模型組;L-NAME(NOS抑制劑)組。致傷大鼠麻醉后將背部脫毛區(qū)浸以100℃沸水15s，制成20％體表面積全層皮膚燙傷模型。對照組則在大鼠麻醉后將背部脫毛區(qū)浸于25℃溫水中15s。
　　2.實驗Ⅰ:對照組:1ml生理鹽水灌胃;模型組:致傷后1ml生理鹽水灌胃;谷氨酰

3、胺治療組:致傷后谷氨酰胺(1.5g/kg)+1ml生理鹽水灌胃;益生菌治療組:致傷后益生菌(300mg/kg)+1ml生理鹽水灌胃;谷氨酰胺+益生菌治療組:致傷后谷氨酰胺(1.5g/kg)+益生菌(300mg/kg)+1ml生理鹽水灌胃。干預措施均為1次/d，連續(xù)7d。于傷后第7d，將各組大鼠麻醉并取腸管及血液樣本。
　　3.實驗Ⅱ:對照組及模型組致傷后即尾靜脈注射1ml生理鹽水;L-NAME組致傷后即尾靜脈注射L-NAME HC

4、L(100mg/kg)。對照組、模型組和L-NAME組大鼠分別于傷后0、1、6，24h收集血液標本，于傷后24h麻醉后取腸組織樣本。
　　二、生化指標檢測
　　1.IL-6、IL-4、IL-8、TNF-α:酶聯免疫吸附法和熒光檢測法。
　　2.ROS、SOD、MDA:化學發(fā)光法。
　　3.NO:NO檢測試劑盒。
　　三、qRT-PCR(Quantitative real-time polymerase ch

5、ain reaction)檢測
　　以各組大鼠腸管提取總RNA，經反轉錄后，使用qRT-PCR技術檢測各組樣本的iNOS、eNOS、nNOS、NF-κB、Bax、EGF、IL-6、TNF-α、sICAM-1、sVCAM-1、PPARγ、DNMT-1、Tet1及GADPH的mRNA表達水平。
　　四、TUNNEL檢測
　　通過TUNNEL試劑盒檢測腸道細胞凋亡情況，測100μm2凋亡細胞個數。
　　五、HE檢測

6、r>　　對各組大鼠的腸道樣本進行HE染色，觀察各組大鼠腸道損傷情況。
　　六、Western blot(WB)
　　用SDS PAGE凝膠電泳分離轉移各組別腸道蛋白并將蛋白轉到PVDF膜上。脫脂奶粉封閉后分別孵以NF-κB、EGF、Bax、IKKB、PERK、ERK、P100、P52、DNMT-1、Tet1、iNOS、eNOS、nNOS、PPARγ和GAPDH抗體。在孵以辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗后以ECL法檢測蛋白表達強

7、度。
　　七、甲基化特異性PCR檢測(Methylation-Specific PCR，MS-PCR)
　　DNA甲基化狀態(tài)制備基因組DNA，DNA在亞硫酸氫鹽處理后，采用DNA甲基化檢測試劑盒用引物進行eNOS、iNOS甲基化DNA擴增。
　　八、數據分析
　　數據分析采用SPSS22.0軟件。數據以平均值±標準差的形式表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認為存在統(tǒng)計學差異。
　　結果：

8、　　一、燒傷可誘發(fā)機體及腸道的氧化應激和炎癥反應，谷氨酰胺和益生菌聯合應用能夠有效控制氧化應激和炎癥反應的程度。
　　采用化學發(fā)光法檢測大鼠燙傷后血液中氧化應激的指標，發(fā)現NO、ROS、MDA在燒傷后處于增高狀態(tài)，且SOD的活力受到嚴重抑制。ELISA檢測發(fā)現血液中IL-6、TNF-α、IL-8均增高，而IL-4降低。谷氨酰胺和益生菌聯合應用能夠有效降低ROS、MDA、NO、TNF-a、IL-6、IL-8在血液中的含量、增高IL-

9、4含量并顯著提高SOD活力。腸組織的氧化應急指標及炎癥因子的檢測結果顯示，除IL-4無明顯變化外，其余指標的變化與血液中的變化趨勢相同。實驗結果說明燒傷誘發(fā)了機體及腸道的氧化應激和炎癥反應，谷氨酰胺和益生菌聯合應用可顯著改善機體及腸道的氧化應激和炎癥狀態(tài)。
　　二、燒傷后NO表達水平可影響機體及腸道的氧化應激和炎癥反應，iNOS通過調控NF-κB而影響腸道炎癥反應的程度。
　　通過qRT-PCR、WB、ELISA和化學發(fā)光法

10、檢測L-NAME對燙傷大鼠氧化應激和炎癥反應的影響，并明確NO在其中發(fā)揮的作用。研究發(fā)現傷后血液中SOD、MDA、ROS、NO的改變要早于IL-6、TNF-α，提示燒傷引發(fā)的氧化應激反應要先于炎癥產生;傷后24h腸道NO、ROS、MDA、TNF-α、IL-6含量明顯升高，SOD明顯降低。L-NAME組腸道NO、ROS、MDA、TNF-α、IL-6含量明顯降低，SOD明顯升高。通過使用NOS抑制劑L-NAME抑制燒傷引發(fā)的NO異常合成，抑

11、制了機體及腸道的氧化應激和炎癥反應，證實了抑制NO可減少機體及腸道的氧化應激標志物和炎癥因子的產生;L-NAME組iNOS表達明顯降低，NF-κB P65表達隨之降低，提示iNOS通過NF-κB而調控炎癥反應。
　　三、谷氨酰胺和益生菌聯合應用對燒傷后腸道損傷的保護作用及相關機制。
　　病理結果顯示谷氨酰胺和益生菌聯合應用能很好的修復腸道損傷，恢復腸道屏障功能。TUNNEL檢測表明聯合應用能明顯減少腸道細胞的凋亡，WB及qR

12、T-PCR檢測發(fā)現聯合應用抑制促凋亡相關蛋白BAX在腸道中的表達，而增高細胞修復相關的細胞因子EGF的表達，從而減少腸道損傷并激活腸道修復。WB及qRT-PCR檢測發(fā)現，聯合應用谷氨酰胺和益生菌可有效降低腸道中iNOS的表達，其通過抑制NF-κB經典途徑而調控炎癥和保護腸道。WB及qRT-PCR檢測還發(fā)現聯合應用谷氨酰胺和益生菌能夠有效增強PPARγ表達，從而抑制NF-κB通路。故谷氨酰胺和益生菌聯合應用對調控iNOS的表達及對腸道的保

13、護具有重要的作用。
　　四、谷氨酰胺和益生菌聯合應用可通過調控iNOS基因的甲基化水平而調控iNOS表達。
　　MS-PCR檢測發(fā)現，iNOS基因的DNA甲基化水平燒傷后出現降低，聯合應用谷氨酰胺和益生菌能夠顯著提高iNOS基因的甲基化水平，而eNOS基因的DNA甲基化水平在燒傷和聯合應用后均沒有明顯改變。WB及qRT-PCR檢測發(fā)現，燙傷后甲基化轉移酶(DNMT-1)顯著降低，去甲基化酶(Tet1)顯著升高。谷氨酰胺和益生

14、菌聯合應用后，DNMT-1的表達水平提高，而Tet1的表達水平降低，實驗結果表明谷氨酰胺和益生菌聯合應用能夠通過調控iNOS基因的甲基化水平而調控iNOS的表達。
　　結論：
　　谷氨酰胺和益生菌聯合應用能通過影響DNA甲基化酶及去甲基化酶的表達，提高iNOS基因的甲基化水平，從而使NO的表達顯著降低，進而抑制了燒傷后腸道的氧化應激及炎癥反應，減少腸道細胞凋亡，改善腸道修復功能并維護腸道的屏障功能。谷氨酰胺和益生菌聯合應用能