谷氨酰胺、甘氨酸及甘谷二肽對燒傷大鼠心肌保護(hù)作用及其信號機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 近年來研究表明，燒傷早期即可出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌損害，引發(fā)心源性休克。目前亦將其稱之為“休克心”，它是燒傷最常見的并發(fā)癥之一[1,2]。由于心臟的特殊性，其損害不僅可引起心功能不全，還可誘發(fā)或加重休克，導(dǎo)致全身其它組織器官出現(xiàn)缺血缺氧性損害，從而引發(fā)燒傷后多器官功能不全，乃至多器官功能衰竭。因此在燒傷早期實(shí)施有效的心肌保護(hù)措施對于糾正休克，減輕臟器損害，減少內(nèi)臟并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。目前臨床上對燒傷后心肌損害的治療主要以補(bǔ)

2、液復(fù)蘇和使用強(qiáng)心藥物為主，雖在一定程度上改善了心肌功能，但存在增加心肌負(fù)荷的不足，有必要尋找新的心肌保護(hù)藥物。 研究表明，谷氨酰胺(Glutamine，Gln)和甘氨酸(Glycine，Gly)對各種原因造成的心肌缺血缺氧性損害具有較好的保護(hù)作用，但谷氨酰胺溶解度低、熱穩(wěn)定性差，不能作為靜脈制劑使用，使之在危重患者中的使用受到限制。以谷氨酰胺和甘氨酸為原料合成的甘氨酰-谷氨酰胺二肽(Glycyl-glutaminedipepti

3、de，Gly-Gln，簡稱甘谷二肽)解決了這個問題。但目前尚未見甘谷二肽對心肌保護(hù)作用的報(bào)道，使用甘谷二肽是否能減輕燒傷后心肌細(xì)胞受損程度，改善心肌功能，以及谷氨酰胺和甘氨酸保護(hù)心肌細(xì)胞的機(jī)制，特別是其如何啟動心肌細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)的信號機(jī)制還不甚清楚。 目的： 本研究通過建立原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞和大鼠燒傷損傷模型，觀察谷氨酰胺、甘氨酸和甘谷二肽對燒傷后大鼠心肌的保護(hù)效應(yīng)；探討谷氨酰胺和甘氨酸啟動心肌細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)作用的信

4、號機(jī)制。以期為甘谷二肽在燒傷臨床的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，為燒傷患者心肌損害的救治提供新的治療手段。 一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 方法： Wistar大鼠136只，體重200±20g，雌雄各半，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于動物實(shí)驗(yàn)室一周，保持溫度和濕度恒定，自由進(jìn)食水，實(shí)驗(yàn)前禁食12h。 1.動物分組和給藥方式大鼠隨機(jī)分為正常對照組(C)、燒傷對照組(B)、谷氨酰胺組(Gln)，甘氨酸組(Gly)，甘谷二肽

5、組(GG)，除C組外每組設(shè)置時相點(diǎn)為燒傷后12、24、48、72小時，每組每時相8只大鼠。C組不予燒傷，其余4組采用10g/L戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉，背部電推剃毛，稱重后于剃毛區(qū)涂抹固體汽油燃燒18s，造成30％TBSAIII。燒傷(經(jīng)病理切片證實(shí))，傷后腹腔注射乳酸林格氏液(50ml/kg)抗休克。Gln組給予谷氨酰胺1.0g/kg.d，Gly組給予甘氨酸0.5g/kg.d，GG組給予甘谷二肽1.5g/kg.d。為使各組

6、大鼠等氮等熱卡，采用補(bǔ)充酪氨酸的方法將各組總氨基酸供給量調(diào)整為1.5g/kg.d。B、Gln和Gly組大鼠分別補(bǔ)充酪氨酸1.5、0.5和1.0g/kg.d。傷后大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。 2.檢測方法和指標(biāo)燒傷后12、24、48、72小時，檢測心肌力學(xué)指標(biāo)后取全血制備血清或血漿；處死大鼠迅速取心臟，切取部分組織福爾馬林液固定；取心尖處約100mg組織，提取總蛋白；剩余心肌組織液氮保存?zhèn)溆谩?(1)心肌組織HE染色，觀察

7、組織形態(tài)學(xué)變化。 (2)自動生化分析儀分析檢測血清心肌酶譜(CK、LDH、AST)的變化。 (3)大鼠左心室插管連接四導(dǎo)生理記錄儀，觀察心肌力學(xué)指標(biāo)(AOSP、AODP、LVSP、+dp/dtmax)的變化。 (4)高效液相檢測心肌組織高能磷酸化合物(AMP、ADP和ATP)含量。 (5)分光光度法檢測心肌組織谷胱甘肽(GSH)含量和血漿乳酸(LD)含量。 (6)蛋白免疫印跡檢測心肌組織HSP70

8、含量。 (7)免疫熒光檢測心肌組織金屬硫蛋白(MT)含量。 二、體外實(shí)驗(yàn) 方法： Wistar新生鼠(出生3天內(nèi))200只，雌雄不限，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。 1.原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)和損傷模型新生鼠全身酒精消毒，剖胸迅速取心臟，切取心尖2/3，冰PBS清洗，眼科剪將組織剪碎至1～3mm3大小，采用胰酶消化分離心肌細(xì)胞，用含有10％胎牛血清和0.01MBrdu的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3天待用。用含

9、10％制備的燒傷血清培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞，建立心肌細(xì)胞燒傷血清損傷模型。 2.細(xì)胞分組和檢測指標(biāo)： (1)心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(C)，燒傷組(B)和給藥組(Gln組給予谷氨酰胺終濃度為12、16和20mmol/L；Gly組給予甘氨酸終濃度為0.8、1.2和1.6mmol/L)。10％燒傷血清損傷30min提取細(xì)胞總蛋白，采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測mTOR及其下游底物P70S6k和4E-BPl的磷酸化程度。 (2)細(xì)

10、胞爬片隨機(jī)分為對照組(C)、燒傷組(B)、給藥組(Gln組谷氨酰胺終濃度為12mmol/L、Gly組甘氨酸終濃度為0.8mmol/L)和阻斷劑組(Gln+R組和Gly+R組，阻斷劑：終濃度為25ng/ml的雷帕霉素)。10％燒傷血清損傷1、3和6h，采用免疫熒光技術(shù)半定量檢測心肌細(xì)胞HSP70和MT含量及微管形態(tài)的變化。 結(jié)果： 1.燒傷后各組大鼠心肌酶譜均升高，CK、LDH于12h上升至最高，AST于24h上升至最高，

11、隨后下降；給藥組各時相酶譜上升程度明顯低于燒傷組，甘谷二肽效果優(yōu)于谷氨酰胺和甘氨酸。 2.燒傷組大鼠損傷12h后心肌間質(zhì)水腫，肌纖維紊亂；24h水腫加劇；48h～72h肌纖維溶解斷裂，胞核消失。使用谷氨酰胺，甘氨酸和甘谷二肽能不同程度減輕心肌病理損害。 3.燒傷后心肌力學(xué)指標(biāo)(AOSP、AODP、LVSP、+dp/dtmax)均不同程度下降，72h降至最低，給藥組心肌力學(xué)指標(biāo)下降幅度明顯低于燒傷對照組，甘谷二肽效果優(yōu)于谷

12、氨酰胺和甘氨酸。 4.燒傷后各組ATP、EC72h下降至最低，ADP、AMP12h升至最高；各給藥組ATP和EC明顯高于燒傷對照組，甘谷二肽效果優(yōu)于谷氨酰胺和甘氨酸。 5.燒傷后各組GSH含量72h降至最低，谷氨酰胺、甘氨酸和甘谷二肽組GSH含量明顯高于燒傷對照組，各組比較甘谷二肽組療效最明顯。 6.正常組織中含有少量MT，燒傷后MT合成有所增加，在傷后72h最高，各給藥組心肌組織MT含量明顯高于燒傷對照組；正常

13、組織中只含有微量HSP70，燒傷后HSP70含量一過性增加。各給藥組HSP70含量明顯高于燒傷對照組，各組比較甘谷二肽組療效最明顯。 7.不同濃度的谷氨酰胺和甘氨酸均能顯著增加mTOR及其下游信號分子P70S6k磷酸化程度；谷氨酰胺和甘氨酸分別在12mmol/L和0.8mmol/L時促進(jìn)4E-BPl磷酸化的作用最明顯，超過該濃度促磷酸化作用有所減弱。 8.正常細(xì)胞含有微量HSP70和MT，燒傷血清損傷后其蛋白含量有所增加

14、，使用谷氨酰胺和甘氨酸能夠促進(jìn)HSP70和MT蛋白合成，在孵育6h時蛋白含量最高。使用雷帕霉素能夠阻斷谷氨酰胺和甘氨酸促進(jìn)HSP70和MT合成的生物效應(yīng)。 9.對照組心肌細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)完整，呈網(wǎng)格排列，染色均勻。燒傷損傷1h微管出現(xiàn)斷裂，染色不均一；3h部分微管明顯缺失，6h微管結(jié)構(gòu)模糊不清。谷氨酰胺和甘氨酸能明顯降低微管受損程度，使用雷帕霉素能阻斷谷氨酰胺和甘氨酸對微管的保護(hù)作用。 結(jié)論： 谷氨酰胺、甘氨酸和甘谷

15、二肽能有效降低燒傷后心肌受損程度，具有很好的心肌保護(hù)作用。甘谷二肽的療效優(yōu)于谷氨酰胺和甘氨酸單獨(dú)給藥，提示谷氨酰胺和甘氨酸的保護(hù)效應(yīng)具有協(xié)同作用。谷氨酰胺、甘氨酸的作用機(jī)制如下： 1.谷氨酰胺和甘氨酸能夠改善心肌能量代謝，促進(jìn)ATP合成，增加細(xì)胞生物能量儲備。 2.谷氨酰胺和甘氨酸能夠促進(jìn)谷胱甘肽和金屬硫蛋白合成，減少自由基生成，減輕心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損害，維護(hù)細(xì)胞正常的能量代謝。 3.谷氨酰胺和甘氨酸能夠促進(jìn)心