腸內(nèi)應(yīng)用甘氨酰谷氨酰胺二肽對(duì)異基因大鼠肝移植后受者機(jī)體代謝、腸道和移植肝結(jié)構(gòu)和功能及長(zhǎng)期存活的作用.pdf

1、第一部分：腸內(nèi)應(yīng)用甘氨酰谷氨酰胺二肽對(duì)異基因大鼠肝移植后機(jī)體代謝的作用 肝移植受者術(shù)前均有程度不同的營(yíng)養(yǎng)不良，原位肝臟移植(OrthotopicLiverTransplantation,OLT)手術(shù)創(chuàng)傷重，機(jī)體術(shù)后處于嚴(yán)重的分解代謝狀態(tài)，伴有相當(dāng)程度的代謝紊亂，術(shù)后長(zhǎng)期處于負(fù)氮平衡狀態(tài)。如何促進(jìn)機(jī)體代謝，尤其是機(jī)體合成代謝，減輕受者應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)重要臟器功能、促進(jìn)受者順利康復(fù)對(duì)臨床肝移植有著重要意義。 谷氨酰胺(

2、Glutamine，Gln)是小腸粘膜及各種快速分化細(xì)胞的特異性營(yíng)養(yǎng)物，在創(chuàng)傷，感染，大手術(shù)等應(yīng)激條件下，機(jī)體對(duì)谷氨酰胺的需求增加，但Gln單體溶解度低，在水溶液中易形成毒性的焦谷氨酸，臨床應(yīng)用受限。甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln)和丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)是兩種常用的人工合成的含Gln二肽，溶解度高，能耐受高溫消毒，臨床應(yīng)用方便，實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)證實(shí)小腸存在二肽載體，在腸功能受損的狀態(tài)下二肽載體仍有較高的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。本實(shí)驗(yàn)首次研究腸內(nèi)

3、應(yīng)用甘氨酰谷氨酰胺二肽對(duì)異基因大鼠肝移植后機(jī)體代謝的作用。 材料與方法: 近交系Lewis大鼠12只作為供者，近交系BN大鼠24只作為受者，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為SPF級(jí)，250-300克。供者隨機(jī)選用，受者隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(丙氨酸組，ALA組)12只：受者術(shù)前三天及手術(shù)后每天采用灌胃給予丙氨酸0.6g/kg.d，術(shù)后連續(xù)應(yīng)用7天。實(shí)驗(yàn)組(二肽組，GLN組)12只：受者術(shù)前三天及手術(shù)后每天采用灌胃給予Gly-Gln0.6g/k

4、g.d，術(shù)后連續(xù)應(yīng)用7天。每組6只正常BN大鼠術(shù)前第三天分別取材作為每組的正常對(duì)照值，每組另6只BN大鼠術(shù)前三天禁食，自由飲水(含0.23％復(fù)方氯化鈉)，在浙江省醫(yī)科院動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室于超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下行原位肝移植術(shù)，術(shù)后均采用CsA2mg/kg.d，皮下注射7天，術(shù)后自由進(jìn)食水，不使用抗生素。 結(jié)論:腸內(nèi)應(yīng)用甘氨酰谷氨酰胺二肽改善了異基因大鼠肝移植術(shù)后血漿、腸粘膜、骨骼肌Gln及蛋白質(zhì)代謝和腸粘膜GSH代謝。

5、 第二部分：腸內(nèi)應(yīng)用甘氨酰谷氨酰胺二肽對(duì)異基因大鼠肝移植后腸道組織結(jié)構(gòu)、吸收功能和屏障功能的作用 肝移植受者多為肝硬化病人，術(shù)前均有程度不同的營(yíng)養(yǎng)不良。移植手術(shù)目前多采用不經(jīng)靜脈轉(zhuǎn)流的經(jīng)典原位肝移植，術(shù)中無(wú)肝期胃腸道淤血45至65分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，小腸粘膜要經(jīng)歷淤血、缺血及再灌注損傷。 如何維護(hù)腸粘膜組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)其吸收功能的恢復(fù)，保護(hù)其屏障功能，減少術(shù)后腸源性感染的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)移植肝功能恢復(fù)和病人康復(fù)，這對(duì)肝移植術(shù)后處

6、于免疫抑制狀態(tài)的病人有著重要的意義。 本實(shí)驗(yàn)首次研究Gly-Gln對(duì)異基因大鼠肝移植術(shù)后腸道組織結(jié)構(gòu)、吸收功能和屏障功能的作用。 討論:肝移植受者術(shù)后胃腸道存在不同程度的腫脹和粘膜損傷，腸道吸收功能受損，腸道微生態(tài)紊亂，腸粘膜屏障功能破壞，易發(fā)生腸腔內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素移位，增加了OLT術(shù)后感染甚至多器官功能障礙綜合癥(MODS)的發(fā)生率，并可能對(duì)移植肝慢性失功能(Chronicgraftdysfunction，CGD)有一定

7、作用。本研究證實(shí)圍手術(shù)期腸內(nèi)應(yīng)用Gly-Gln維護(hù)了大鼠肝移植后小腸的組織結(jié)構(gòu)，尤其是超微結(jié)構(gòu)，提高了腸粘膜Na+-K+-ATP酶活性和雙糖酶活性，促進(jìn)了小腸的吸收功能，減少了腸腔細(xì)菌易位，調(diào)理了肝移植后紊亂的微生態(tài)，保護(hù)了腸粘膜屏障功能。這可能是由于腸內(nèi)應(yīng)用Gly-Gln二肽可以有效地被腸粘膜吸收，并在體內(nèi)分解，顯著改善了肝移植術(shù)后血漿、小腸粘膜、骨骼肌中Gln、蛋白質(zhì)的代謝，通過(guò)直接的腸粘膜營(yíng)養(yǎng)作用和GSH抗氧化損傷作用，并間接的調(diào)

8、整了腸道微生態(tài)，進(jìn)而維護(hù)了腸粘膜的組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了小腸吸收功能和屏障功能的康復(fù)。 結(jié)論:腸內(nèi)應(yīng)用甘氨酰谷氨酰胺二肽改善了異基因大鼠肝移植后腸粘膜組織結(jié)構(gòu)、吸收功能和屏障功能，調(diào)理了腸道微生態(tài)。 第三部分：腸內(nèi)應(yīng)用甘氨酰谷氨酰胺二肽對(duì)異基因大鼠肝移植后移植肝代謝、結(jié)構(gòu)和功能的作用 肝移植過(guò)程中移植肝臟不可避免的遭受缺血再灌注損傷(ischemiareperfusioninjury，I/RI)，術(shù)后使用免疫抑制劑又可

9、能造成肝臟毒性，加之腸腔細(xì)菌易位，膽道功能紊亂，這些因素與肝移植術(shù)后的諸多并發(fā)癥均相關(guān)，嚴(yán)重者導(dǎo)致原發(fā)性移植肝無(wú)功能(PNF)。 材料與方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、隨機(jī)分組、圍手術(shù)期處理，實(shí)驗(yàn)取材均參照研究一，每只大鼠均測(cè)定：血漿GSH、門(mén)靜脈血中內(nèi)毒素，移植肝組織丙二醛(MDA)含量和蛋白質(zhì)含量、GSH-PX的活性、肝臟酶譜變化，肝臟常規(guī)和超微病理結(jié)構(gòu)。 結(jié)果:術(shù)后第8天兩組受者大鼠肝臟常規(guī)和超微病理結(jié)構(gòu)較術(shù)前第三天變差，兩組移植

10、肝組織MDA含量，肝臟酶譜、門(mén)靜脈血中內(nèi)毒素均較術(shù)前第三天明顯升高，術(shù)后第8天GLN組血漿GSH、移植肝組織蛋白質(zhì)含量、GSH-PX活性均顯著高于ALA組。但GLN組門(mén)靜脈血中內(nèi)毒素、肝臟酶譜顯著低于同期ALA組。常規(guī)病理結(jié)構(gòu)顯示術(shù)后第8天肝臟表現(xiàn)為小膽管增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等損傷表現(xiàn)，GLN組好于ALA組，超微結(jié)構(gòu)顯示GLN組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，線(xiàn)粒體無(wú)腫脹，明顯好于ALA組。 在肝移植外科手術(shù)中，無(wú)肝期將導(dǎo)致下面損傷：(1)門(mén)靜脈淤血和

11、缺血，(2)動(dòng)脈及淤滯門(mén)靜脈血的再灌注損傷，而再灌注過(guò)程將同時(shí)導(dǎo)致移植肝的損傷。本實(shí)驗(yàn)中Gln組術(shù)后第8天門(mén)靜脈血中內(nèi)毒素顯著下降，與研究二GLN組肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)、腎臟細(xì)菌培養(yǎng)數(shù)量顯著減少是一致的。說(shuō)明腸內(nèi)應(yīng)用甘氨酰谷氨酰胺二肽改善異基因大鼠肝移植后腸粘膜組織結(jié)構(gòu)、吸收功能和屏障功能，調(diào)理腸道微生態(tài)可能是改善移植肝代謝、組織結(jié)構(gòu)和功能的重要機(jī)制。 結(jié)論:腸內(nèi)應(yīng)用甘氨酰谷氨酰胺二肽改善了異基因大鼠肝移植后移植肝代謝、組織結(jié)構(gòu)

12、和功能。 第四部分：腸內(nèi)長(zhǎng)期應(yīng)用甘氨酰谷氨酰胺二肽對(duì)異基因大鼠肝移植后免疫抑制狀態(tài)下長(zhǎng)期生存的研究 過(guò)去十年中，實(shí)體器官移植取得了巨大進(jìn)展，在許多發(fā)達(dá)移植中心肝移植后受者1年生存率已達(dá)到90％?，F(xiàn)在對(duì)于受者來(lái)說(shuō)，獲得長(zhǎng)期良好的生存質(zhì)量是最重要的目。慢性移植物失功是指移植物功能緩慢和不可逆性減退，以往稱(chēng)為慢性排斥反應(yīng)、晚期移植物失功、晚期移植物丟失。美國(guó)UNOS(unitednetworkoforganshare)公布的全

13、球臨床器官移植長(zhǎng)期存活結(jié)果顯示，在規(guī)范化長(zhǎng)期免疫抑制劑治療下，仍有30％～70％的移植器官在5年內(nèi)不明原因地發(fā)生慢性移植物失功而致病人死亡或需再次移植。 本研究以SPF級(jí)異基因大鼠肝移植模型為基礎(chǔ)，肝移植后長(zhǎng)期使用CsA，研究缺血再灌注損傷、腸粘膜屏障功能、腸道微生態(tài)、細(xì)菌易位、術(shù)后代謝、免疫抑制劑的毒副作用等因素對(duì)移植物長(zhǎng)期有功能存活的的關(guān)系，并探討長(zhǎng)期腸內(nèi)應(yīng)用Gly-Gln對(duì)移植肝長(zhǎng)期有功能存活的影響和探討與慢性移植物失功的

14、關(guān)系。 材料與方法:近交系雄性L(fǎng)EWrat(RT11)大鼠24只作為供者，近交系雄性BN(RT1n)24只大鼠作為受者。 結(jié)果:對(duì)照組(ALA組)大鼠死亡原因統(tǒng)計(jì)包括：肝葉壞死2只，腹腔感染2只，膽道慢性梗阻及增生性病變4只。實(shí)驗(yàn)組(GLN組)大鼠死亡原因統(tǒng)計(jì)包括：肝葉壞死2只，腹腔感染1只，膽道慢性梗阻及慢性增生性病變2只，采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存曲線(xiàn)分析，GLN組明顯好于ALA組。 討論:此研

15、究中心內(nèi)容在于揭示缺血再灌注損傷、腸粘膜屏障功能、腸道微生態(tài)、細(xì)菌易位、術(shù)后代謝、免疫抑制劑的毒副作用等非特異性免疫和非免疫因素對(duì)移植物長(zhǎng)期有功能存活的影響，采用Kaplan-Meier的方法分析生存曲線(xiàn)，大鼠死亡原因包括：肝葉壞死、腹腔感染、膽道慢性梗阻及增生性病變，分別代表了肝移植后的重要病理變化，肝臟缺血再灌注損傷引發(fā)的肝葉壞死、腸道細(xì)菌易位引發(fā)的腹腔感染、膽道的并發(fā)癥和慢性炎性反應(yīng)性改變引發(fā)的膽道慢性梗阻及慢性增生性病變和肝功能

16、衰竭。采用Kamada模型，大鼠肝移植后因未吻合肝動(dòng)脈膽道失去了血液供給，并且缺少神經(jīng)支配，采用放置膽管支架管的膽管吻合方式，膽管內(nèi)易形成膽泥和結(jié)石，造成不全性梗阻，在隱性感染的基礎(chǔ)上容易發(fā)生細(xì)菌和內(nèi)毒素移位、微生態(tài)失衡的產(chǎn)物進(jìn)入肝臟侵蝕移植物，引起膽道慢性梗阻及慢性增生性病變，導(dǎo)致肝硬化和肝功能衰竭，膽道慢性梗阻增生性病變可能是大鼠肝移植后移植肝慢性失功的一種重要類(lèi)型。長(zhǎng)期腸內(nèi)應(yīng)用Gly-Gln二肽可能通過(guò)直接促進(jìn)了移植肝臟合成代謝和