連續(xù)性血液凈化治療對MODS患者腸粘膜屏障功能障礙的影響及其作用機制.pdf

1、腸道不僅是一個營養(yǎng)吸收器官而且也是有效阻擋腸腔內(nèi)各種有害物質(zhì)如細菌和毒素進入血液循環(huán)的屏障。腸黏膜上皮組織正常結(jié)構(gòu)和功能的維持在防止腸道內(nèi)大分子毒素和細菌跨上皮細胞和細胞旁路進入血液循環(huán)中起關鍵作用。腸黏膜上皮細胞間有一種特殊的結(jié)構(gòu)叫緊密連接，由多種功能各異的蛋白質(zhì)包括Occludin和ZO-1等組成并包繞在上皮細胞的腔側(cè)端，受到細胞因子的高度調(diào)節(jié)并影響整個腸黏膜屏障的通透性。該結(jié)構(gòu)可有效地阻止腸腔內(nèi)細菌、毒素及炎性介質(zhì)等物質(zhì)的旁細胞轉(zhuǎn)

2、運，維持腸粘膜上皮屏障功能的完整，并對其所圍繞的細胞造成膜質(zhì)的區(qū)域性差異，使這些區(qū)域可進行專一的功能活動，如離子的定向轉(zhuǎn)運等，其結(jié)構(gòu)破壞可導致腸黏膜通透性增高，使得腔內(nèi)大分子毒素穿過腸道正常保護層進入體內(nèi)循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)在炎癥性腸病和感染性小腸炎中，緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白解聚和重組是其腸道屏障功能受損的主要病理改變。一些促炎介質(zhì)可下調(diào)Occludin和ZO-1的表達并使其發(fā)生重排。最近研究發(fā)現(xiàn)，腸上皮細胞內(nèi)iNOS和NO表達增加與腸道粘膜上皮細

3、胞受損及緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白Occludin和ZO-1的表達下降有密切關系。在病理狀態(tài)下，NO主要是由iNOS大量合成。iNOS可被細菌或細胞因子誘導產(chǎn)生，在介導炎癥因子導致的腸上皮通透性增高中起了重要作用。
　　 CBP已成為危重患者的治療手段，尤其對多器官功能衰竭的搶救工作帶來了極大方便和成為有效的救治措施，在MODS的治療中CBP不僅作為一種血液濾過技術(shù)來清除炎癥介質(zhì)，而且在治療中發(fā)揮了強大的免疫調(diào)節(jié)作用，這是CVVH治療MO

4、DS新理念的一個重要依據(jù)。但是，CVVH是否通過改善腸黏膜屏障功能，減少細菌和毒素移位，減輕組織和器官損傷從而改善MODS的預后，目前未見文獻報道。在本研究中，我們觀察CBP對腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白、iNOS的表達和P38MAPK活化的影響，探討CVVH改善MODS患者腸粘膜屏障功能障礙的機制。
　　 方法：
　　 1.收集了2007年12月至2009年5月從我院各科室病房轉(zhuǎn)到中心ICU治療的22例MODS患者作為研究對

5、象，根據(jù)患者的預后分為存活組和死亡組。以20例健康志愿者作為正常對照。MODS的診斷依據(jù)美國胸科醫(yī)師協(xié)會/危重病醫(yī)學學會大會制定的標準。所有病人在確診MODS之后的4小時之內(nèi)開始在常規(guī)綜合治療基礎上聯(lián)合連續(xù)性靜脈血液濾過（CVVH）治療，分別于CVVH前（0h），CVVH治療開始后6h，12h和20h時采集靜脈血，無菌塑料試管盛裝，在室溫下2000g離心10分鐘，分離血清，小量分裝后于-70℃貯藏待用，同時收集治療2hr時的置換廢液。以

6、血清二氨氧化酶（ADO）、D-乳酸和內(nèi)毒素水平以及腸黏膜上皮細胞的通透性作為評價腸黏膜屏障功能的指標，以緊密連接蛋白分布和表達的變化作為腸黏膜破壞的標志；動態(tài)觀察CVVH治療前后患者血壓、心率、呼吸、APACHⅡ評分、血清二氨氧化酶（ADO）、D-乳酸和內(nèi)毒素水平的變化情況。
　　 2.分光光度法檢測血清二胺氧化酶和D-乳酸水平，鱟試劑偶氮基質(zhì)顯色法定量檢測血清內(nèi)毒素水平。
　　 3.用Caco-2細胞在體外建立單層腸粘

7、膜上皮模型，采用MODS患者CVVH治療前后各時間點無菌收集的血清和治療2hr時的置換廢液體外刺激培養(yǎng)，分別以健康正常人血清和置換液培養(yǎng)作為對照。Fluorescence reader檢測單層腸粘膜上皮細胞對熒光素標記的葡聚糖4000（FD4）的通透量和millicell-ERS電阻儀檢測其跨膜電阻（TER）來評價腸粘膜上皮的通透性及CVVH對其影響。
　　 4.免疫熒光染色檢測上述各組刺激培養(yǎng)的Caco-2單層腸粘膜上皮細胞緊

8、密連接蛋白Occludin和ZO-1的分布和重排情況；Wes-tern blot檢測細胞緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達水平的變化。
　　 5.Western blot檢測上述各組刺激培養(yǎng)的上皮細胞中磷酸化P38M--APK的蛋白表達水平的變化。
　　 6.應用RT-PCR方法檢測上述各組刺激培養(yǎng)的上皮細胞內(nèi)iNOS的基因表達水平的變化。
　　 7.用比色法檢測上述各組刺激培養(yǎng)的上皮細胞內(nèi)NO水平的變化

9、。
　　 結(jié)果：
　　 1.CBP治療過程中MODS患者臨床表現(xiàn)和全身狀況的變化：MODS患者在CVVH治療時血流動力學穩(wěn)定，收縮壓，舒張壓和平均動脈壓均無明顯波動，心率在CVVH治療6小時后有所下降，此后一直穩(wěn)定至治療結(jié)束。12個患者在開始行CVVH治療時需要至少一種血管活性藥物維持正常血壓，其中有3個患者同時需要兩種藥物聯(lián)合，有2個患者同時需要三種藥物聯(lián)合。CVVH治療后，上述8位患者血管活性藥用藥劑量或數(shù)量減少，4

10、位患者血管活性藥物維持在治療前水平。15位合并代謝性酸中毒的患者在CBP治療12-20小時后得以糾正，10位患者的急性腎功能衰竭在CBP治療后也得以減輕。每個患者根據(jù)病情需要進行1-5次CVVH治療，其中12例患者存活，10例患者死亡。MODS患者死亡組的APACHEⅡ評分顯著高于存活組，治療20小時后，兩組患者APACHEⅡ評分都較治療前下降，存活組下降程度顯著大于死亡組。
　　 2.MODS患者腸道屏障功能的變化及CBP對其

11、影響：與正常對照組相比，MODS患者存在明顯的腸黏膜屏障功能障礙，表現(xiàn)為MODS患者血清DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平以及MODS患者血清刺激培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細胞的通透性明顯增高。與MODS存活組相比，MODS死亡組外周血DAO、D-乳酸和內(nèi)毒素水平及其血清刺激培養(yǎng)的腸粘膜上皮細胞的通透性增高更顯著。在CVVH治療過程中，與治療前相比存活組外周血內(nèi)毒素水平在6h明顯下降，死亡組在12小時下降，兩組患者外周血DAO水平在20小時明顯下降

12、；存活組患者下降幅度顯著高于死亡組。
　　 3.MODS患者血清誘導的單層腸粘膜上皮細胞通透性的變化及CBP治療對其影響：與正常對照組相比，MODS存活組和死亡組患者治療前血清誘導的單層腸黏膜上皮細胞對FD4的通透性增高和跨上皮細胞TEER下降，CBP治療6h血清誘導的單層腸黏膜上皮細胞對FD4的通透性下降，并且TEER明顯增加，12h達最佳效果，20h時效果略有下降。尤其以存活組患者單層腸黏膜上皮細胞通透性改善更為顯著，顯著優(yōu)

13、于死亡組；與置換液對照組比較，置換廢液誘導的單層腸黏膜上皮細胞對FD4的通透性增高和TEER下降。
　　 4.MODS患者血清誘導的單層腸粘膜上皮細胞緊密連接蛋白重排及CBP對其影響：正常單層腸粘膜上皮細胞的Occludin和ZO-1主要分布在細胞周邊并在細胞與細胞接觸的部位形成連續(xù)光滑的緊密連接條帶，與細胞構(gòu)成蜂窩狀。與正常對照組相比，MODS患者血清培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細胞可見occludin和ZO-1分布發(fā)生改變，其染色減

14、弱，連續(xù)性中斷，部分斷裂且細胞間連接松散，CVVH6h時機密連接蛋白重排減輕，細胞間緊密連接不規(guī)則和松散得以改善，尤以12小時最為明顯，并持續(xù)到20小時。
　　 5.MODS患者血清誘導的單層腸粘膜上皮細胞緊密連接蛋白表達變化及CBP對其影響：與正常對照組相比，CVVH治療前MODS患者血清刺激培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細胞Occludin和ZO-1蛋白表達水平下降，治療6小時后Occludin和ZO-1蛋白表達水平升高，12小時后表

15、達水平升高接近正常水平，持續(xù)到治療20小時。
　　 6.MODS患者血清誘導的單層腸上皮細胞iNOSmRNA和NO表達水平的變化及CBP對其影響：與正常對照組相比，CVVH治療前MODS患者血清刺激培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細胞iNOS基因表達和NO生成水平明顯升高，在CVVH治療6小時后，單層腸黏膜上皮細胞iNOS基因表達和NO生成水平下降，治療12小時達最佳效果，20小時效果略有下降，但與治療6小時相比無統(tǒng)計學意義。
　　

16、 7.MODS患者血清誘導的腸上皮細胞P38 MAPK信號通路活化與iNOSmRNA表達的關系及其對TJs蛋白表達和分布的影響：與正常對照組相比，MODS患者血清刺激培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細胞P38MAPK活性明顯增高。P38MAPK信號通路抑制劑SB203580干預后，iNOSmRNA表達和NO生成水平明顯降低；同時Occludin和ZO-1蛋白表達水平和組合也明顯改善。
　　 8.CVVH對P38MAPK信號通路的影響：與CV

17、VH治療前MODS患者血清刺激培養(yǎng)的單層腸粘膜上皮細胞相比，在CVVH治療6小時后的單層腸黏膜上皮細胞P38MAPK表達水平下降，治療12小時達最佳效果，20小時效果略有下降，但與治療6小時相比無統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.MODS患者存在腸粘膜屏障功能損害，其損害程度可能與患者的病情嚴重性和預后有相關。
　　 2.連續(xù)性血液凈化（CBP）治療不僅有效改善MODS患者的全身狀況如.APACHEⅡ評分，同

18、時也改善了患者腸粘膜屏障功能的損害。
　　 3.MODS患者腸粘膜上皮細胞緊密連接蛋白Occludin和ZO-1重排和表達下調(diào)參與了其腸粘膜屏障損害的過程，連續(xù)性血液凈化治療有效改善了Occludin和ZO-1連接蛋白的重排和表達。
　　 4.CBP治療對：MODS患者腸粘膜屏障的這種保護作用可能與其限制SIRS和氧化應激進而下調(diào)P38MAPK信號通路活性，抑制iNOSmRNA表達，減少NO生成有關，從而改善了MODS患