IGF-Ⅰ對肝硬化大鼠腸粘膜屏障保護作用的研究.pdf

1、本研究共分三部分
　　第一部分 IGF-Ⅰ對肝硬化大鼠腸粘膜屏障保護作用機制的研究
　　第二部分 IGF-Ⅰ對LPS損傷Caco-2細胞通透性影響及機制的研究
　　第三部分 肝硬化患者IGF-Ⅰ與肝功嚴重程度的相關(guān)性分析
　　第一部分 IGF-Ⅰ對肝硬化大鼠腸粘膜屏障保護作用的研究
　　目的:
　　研究外源性補充IGF-Ⅰ對肝硬化大鼠腸緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1表達的調(diào)節(jié)，研究I

2、GF-Ⅰ對肝硬化大鼠門脈中IGF-Ⅰ及內(nèi)毒素的影響，研究IGF-Ⅰ對肝硬化大鼠腸上皮細胞凋亡的作用。探討研究外源性IGF-Ⅰ對肝硬化大鼠IB保護作用的機制。
　　方法:
　　1.將30只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為對照組、模型組及模型治療組。模型組腹腔內(nèi)注射四氯化碳(0.2ml/kg/d)6周誘導大鼠肝硬化模型，對照組腹腔內(nèi)注射生理鹽水(0.2ml/kg/d)6周。模型治療組腹腔內(nèi)注射四氯化碳(0.2

3、ml/kg/d)6周，后皮下注射重組人IGF-Ⅰ(0.2μg/kg/d)21天。
　　2.給藥結(jié)束后，禁食水24h，對三組大鼠進行門靜脈壓力測定。留取門脈血液、肝組織及盲腸。
　　3.應用試劑盒檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。
　　4.應用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清IGF-Ⅰ水平

4、，采用鱟試驗檢測血漿內(nèi)毒素水平。對肝組織進行HE染色及Masson染色，觀察肝臟組織形態(tài)，并應用Image proplus軟件對肝纖維化進行定量分析。
　　5.通過western blot及RT-PCR方法觀察大鼠盲腸中Occludin和Claudin-1蛋白及基因表達情況。
　　6.應用TUNEL法檢測盲腸細胞凋亡情況，并應用RT-PCR檢測盲腸凋亡基因Bax及Bcl-2的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.HE及

5、Masson染色顯示，于6周時肝硬化組大鼠發(fā)生肝硬化，表明造模成功。
　　2.模型治療組肝纖維化程度明顯低于模型組(P＜0.01)。
　　3.肝硬化組門脈壓力明顯高于對照組(P＜0.001)，模型治療組門脈壓力明顯低于模型組(P＜0.001)。
　　4.肝硬化組血清ALT及AST水平明顯高于對照組(P＜0.001)。模型治療組血清ALT及AST水平明顯低于模型組(P＜0.001)。
　　5.肝硬化組門脈血清IGF

6、-Ⅰ明顯低于對照組(P＜0.001)，模型治療組門脈血清IGF-Ⅰ明顯高于模型組(P＜0.001);肝硬化組門脈血漿內(nèi)毒素水平明顯高于對照組(P＜0.001)，模型治療組門脈血漿內(nèi)毒素明顯低于模型組(P＜0.001)。
　　6.肝硬化組盲腸中Occludin(P＜0.001)和Claudin-1(P＜0.001)蛋白表達及基因表達均低于對照組。模型治療組盲腸中Occludin(P＜0.001)和Claudin-1(P＜0.001)

7、蛋白表達及基因表達均高于模型組。
　　7.TUNEL表明，模型組凋亡水平明顯高于對照組(P＜0.001)，模型治療組凋亡水平明顯低于模型組(P＜0.001)。模型組Bax基因表達明顯高于對照組(P＜0.001)，模型治療組Bax基因表達明顯低于模型組(P＜0.001);模型組Bcl-2基因表達明顯低于對照組(P＜0.001)，模型治療組Bcl-2基因表達明顯高于模型組(P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　外源性補充IG

8、F-Ⅰ在一定程度上恢復了肝硬化大鼠血中IGF-Ⅰ水平，改善肝硬化大鼠腸粘膜屏障功能，降低內(nèi)毒素水平，進而改善肝功能，降低門脈壓力，減輕肝纖維化。
　　第二部分 IGF-Ⅰ對LPS損傷Caco-2細胞通透性影響及機制的研究
　　目的:
　　考察外源性IGF-Ⅰ對Caco-2單層細胞通透性的影響，并探討IGF-Ⅰ對Caco-2單層細胞緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1表達的調(diào)節(jié)作用，觀察IGF-Ⅰ對Caco-

9、2單層細胞凋亡的影響，進一步印證動物實驗結(jié)論。
　　方法:
　　1.Caco-2單層細胞模型建立及及細胞分組:應用高糖DMEM培養(yǎng)人結(jié)直腸腺瘤細胞系Caco-2細胞。給藥前，取對數(shù)生長期的Caco-2細胞接種于6孔板，并應用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。細胞分為四組:LPS組應用LPS(10μg/ml)作用細胞24小時;IGF-Ⅰ組應用IGF-Ⅰ(100ng/ml)作用細胞24小時;LPS+IGF-Ⅰ組應用LPS(10μ

10、g/ml)及IGF-Ⅰ(100ng/ml)同時作用細胞24小時;不給藥組為對照組，每組設(shè)6個重復孔。
　　2.應用跨膜電阻(transepithelial electrical resistance，TEER)測量各組單層細胞的通透性。
　　3.通過western blot及RT-PCR方法觀察Caco-2單層細胞中Occludin和Claudin-1蛋白及基因表達情況。
　　4.應用TUNEL法檢測不同處理組單層細胞

11、凋亡情況，并應用RT-PCR檢測Caco-2單層細胞凋亡基因Bax及Bcl-2的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.IGF-Ⅰ組TEER明顯高于對照組(P＜0.001)， LPS+IGF-Ⅰ組TEER明顯高于LPS組(P＜0.001)。
　　2.IGF-Ⅰ組Occludin(P＜0.001)和Claudin-1(P＜0.001)蛋白表達明顯高于對照組， IGF-Ⅰ組Occludin(P＜0.001)和Claudin-1(P

12、＜0.001)基因表達表達明顯高于對照組。LPS+IGF-Ⅰ組Occludin(P＜0.001)和Claudin-1(P＜0.001)蛋白表達明顯高于LPS組，LPS+IGF-I組Occludin(P＜0.001)和Claudin-1(P＜0.001)基因表達表達明顯高于LPS組。
　　3.TUNEL表明，IGF-I組凋亡水平明顯低于對照組(P＜0.001)，LPS+IGF-Ⅰ組凋亡水平明顯低于LPS組(P＜0.001)。

13、　　4.IGF-Ⅰ組Bax基因表達水平明顯低于對照組(P＜0.001)，LPS+IGF-Ⅰ組Bax基因表達水平明顯低于LPS組(P＜0.001)。IGF-Ⅰ組Bcl-2基因表達水平明顯高于對照組(P＜0.001)，LPS+IGF-Ⅰ組Bcl-2基因表達水平明顯高于LPS組(P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　外源性IGF-Ⅰ可以增加Caco-2單層細胞緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1表達，并下調(diào)Caco-2單

14、層細胞凋亡水平，進而降低Caco-2單層細胞通透性。
　　第三部分 肝硬化患者IGF-1與肝功嚴重程度的相關(guān)性分析
　　目的:
　　分析肝硬化患者胰島素樣生長因子Ⅰ與肝功嚴重程度的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.收集2014年8月至2015年3月在大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院住院治療診斷為肝硬化患者101例。根據(jù)肝功能Child-Push分級及評分標準分為三組，A組(A級，5-6分)、B組(B級，7-9分)、C組

15、(C級，10-15分)。根據(jù)MELD評分標準分為三組，D組(＜11分)、E組(11-18分)、F組(≥18)。
　　2.收集患者住院后的首次檢驗檢查指標，檢測血清白蛋白(Albumin，ALB)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、肌酐(Creatinine，肌酐)、凝血酶原時間(prothrombintime，PT)、國際標準化比率(international normalized radio，INR)。應用酶

16、聯(lián)免疫吸附實驗測定血清IGF-Ⅰ水平。
　　結(jié)果:
　　1.在肝硬化的病因中，既往有飲酒史占總?cè)藬?shù)的14.85％;病毒性肝炎占總?cè)藬?shù)的52.48％;自身免疫性肝病占總?cè)藬?shù)的23.76％;其他原因者占總?cè)藬?shù)的8.91％。在失代償患者中，出現(xiàn)腹腔積液的占總?cè)藬?shù)的58.42％，出現(xiàn)自發(fā)性腹膜炎的占總?cè)藬?shù)的11.88％，出現(xiàn)消化道出血的占總?cè)藬?shù)的31.68％，出現(xiàn)肝性腦病的占總?cè)藬?shù)的48.51％。
　　2.IGF-Ⅰ與Chil

17、d-Pugh評分、MELD評分、凝血酶原時間、總膽紅素及INR均呈明顯負相關(guān)，IGF-Ⅰ與血清白蛋白呈明顯正相關(guān)，IGF-Ⅰ與患者的腎功能無相關(guān)性。
　　3.Child-Pugh分級越高，IGF-Ⅰ的水平就越低。在A組、B組、C組之間進行兩兩比較時發(fā)現(xiàn)，A組與B組、C組比較，P值均小于0.001，說明A組與B組、C組之間差異顯著。而在B組和C組之間比較時，P值為0.327，沒有統(tǒng)計學意義，說明在B組和C組之間，IGF-Ⅰ水平?jīng)]有差

18、異。
　　4.MELD分數(shù)越高，IGF-Ⅰ的水平就越低。在D組、E組、F組之間進行兩兩比較時發(fā)現(xiàn)，D組與E組、F組比較，P值均小于0.001，說明D組與E組、F組之間差異顯著。而在E組和F組之間比較時，P值為0.658，沒有統(tǒng)計學意義，說明在E組和F組之間，IGF-Ⅰ水平?jīng)]有差異。
　　結(jié)論:
　　本文論證了IGF-Ⅰ與Child-Push分級、MELD評分、評價肝功能的主要指標均有相關(guān)性，故IGF-Ⅰ可以作為評估肝臟