2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開論述:
  第一部分 Ox-LDL調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞DKK1的表達(dá)及相關(guān)分子機(jī)制
  研究背景:
  動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)的發(fā)病率與日俱增,易損斑塊發(fā)生的破裂和繼發(fā)的血栓形成,是誘發(fā)急性冠脈綜合征、心肌梗死和中風(fēng)等多種疾病的主要機(jī)制之一。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,動脈粥樣硬化始于血管壁內(nèi)皮損傷,單核細(xì)胞募集并遷入內(nèi)膜下轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞,識別并吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞,同時(shí)募集白細(xì)胞、平

2、滑肌細(xì)胞等進(jìn)入斑塊,積聚脂質(zhì)、中央核心壞死,導(dǎo)致斑塊破裂的發(fā)生。
  氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的重要因素。研究發(fā)現(xiàn),ox-LDL可以損傷內(nèi)皮,誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化,促進(jìn)平滑肌增殖遷移,加速泡沫細(xì)胞形成,引起炎癥反應(yīng),加劇脂質(zhì)沉積等動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程。
  研究目的:
  (1)明確ox-LDL對巨噬細(xì)胞中DKK1的調(diào)節(jié)作用;
  (2)明確LXRs在ox-LDL調(diào)節(jié)DKK1

3、中的作用;
  (3)明確β-catenin與LXRs的相互作用在ox-LDL調(diào)節(jié)DKK1中的作用。
  研究方法:
  1.細(xì)胞培養(yǎng)
  購自ATCC的人單核/巨噬細(xì)胞系以RPMI-1640(含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)懸浮培養(yǎng)。并以終濃度為160nM的PMA誘導(dǎo)貼壁為巨噬細(xì)胞,作為實(shí)驗(yàn)的模型細(xì)胞。
  2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
  β-catenin、LXRα和LXRβ的siRNA和陰性對照Nega

4、tive control siRNA均由上海吉瑪公司合成,按照脂質(zhì)體Lipo-2000的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染后,給予不同的刺激并檢測。
  3.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)
  提取不同刺激后細(xì)胞的蛋白,99℃加熱10分鐘,SDS-PAGE電泳,按照對應(yīng)的分子量切膠,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育4℃過夜,洗膜后二抗孵育1小時(shí)20分鐘,洗去附著的二抗,化學(xué)發(fā)光,分析對應(yīng)的蛋白條帶的灰度值。
  4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR

5、分析
  刺激結(jié)束后利用Trizol法提取細(xì)胞中的總核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA),測定提取的RNA濃度,使用TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary Deoxyribonucleic Acid,cDNA),再使用TaKaRa公司的SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng),以測定DKK1和內(nèi)參蛋白的mRNA表達(dá)情況。
  研究結(jié)果:

6、
  1.ox-LDL上調(diào)巨噬細(xì)胞DKK1的表達(dá)
  2.經(jīng)典Wnt通路參與ox-LDL對巨噬細(xì)胞中DKK1表達(dá)的調(diào)節(jié)
  3.LXRα參與ox-LDL對巨噬細(xì)胞中DKK1表達(dá)的調(diào)節(jié),而LXRβ不參與
  4.ox-LDL下調(diào)巨噬細(xì)胞中LXRs與β-catenin的相互作用
  結(jié)論:
  (1) ox-LDL能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞中DKK1的表達(dá);
  (2) ox-LDL能夠減少LXRα對β-ca

7、tenin的抑制作用來上調(diào)DKK1的表達(dá)。
  第二部分 DKK1抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及相關(guān)脂質(zhì)受體的變化
  研究背景:
  DKK1與脂肪代謝存在著密不可分的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),DKK1能夠促進(jìn)脂肪生成的過程,同時(shí)發(fā)現(xiàn)可源于脂肪細(xì)胞分布異常的成人肥胖,其脂肪生成過程異常主要由于經(jīng)典Wnt通路的異?;罨偷退降腄KK1所致。在動脈粥樣硬化過程中DKK1與巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝功能是否存在著一定的聯(lián)系未見報(bào)道。
  

8、巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)變?yōu)榕菽?xì)胞在動脈粥樣硬化中起到了重要的作用。巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝主要分為脂質(zhì)的吞噬、轉(zhuǎn)化和排出三個(gè)過程來維持其穩(wěn)態(tài)和平衡。巨噬細(xì)胞通過胞膜受體識別攝取脂蛋白和脂蛋白顆粒,并運(yùn)送到溶酶體后被分解為氨基酸及游離膽固醇。繼而酯酰輔酶A膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(ACAT)將其轉(zhuǎn)化為膽固醇酯儲存在胞質(zhì)中。當(dāng)膽固醇接收體如HDL、apoA-Ⅰ等存在時(shí),胞內(nèi)的游離膽固醇可經(jīng)過胞膜上的受體ABCA1、ABCG1等外流,減少胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)過度沉積。<

9、br>  在動脈粥樣硬化過程中DKK1與巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝功能是否存在著一定的聯(lián)系未見報(bào)道。
  研究目的:
  (1)明確DKK1對巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用;
  (2)明確經(jīng)典Wnt通路在DKK1調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中發(fā)揮的作用;
  (3)明確巨噬細(xì)胞中DKK1對脂質(zhì)受體LOX-1和ABCA/G1的調(diào)節(jié)及相關(guān)信號通路。
  研究方法:
  1.細(xì)胞培養(yǎng)
  本實(shí)驗(yàn)使用的THP-1細(xì)胞系為單核/巨噬細(xì)

10、胞系,購自美國ATCC中心。將PMA加入培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁生長,成為THP-1來源的巨噬細(xì)胞。
  2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
  DKK1、β-catenin和STAT3的siRNA和陰性對照Negative contro1 siRNA均由上海吉瑪公司合成,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染,具體步驟參照Lipo-2000的說明書進(jìn)行。
  3.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)
  刺激結(jié)束后RIPA裂解液提取蛋白,加入5×蛋白上

11、樣緩沖液,煮沸,SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育4℃過夜,洗去附著的一抗,對應(yīng)的二抗室溫孵育,洗去附著的二抗,化學(xué)發(fā)光法檢測相應(yīng)的蛋白灰度值。
  4.細(xì)胞油紅O染色
  刺激結(jié)束后,4%甲醛固定細(xì)胞,使用配制的油紅O工作液染色10分鐘,洗去浮色,蘇木素染核2分鐘,鹽酸酒精分化15秒,置于清水中返藍(lán)7分鐘,甘油明膠封片短期保存,并拍照統(tǒng)計(jì)脂質(zhì)沉積情況。
  研究結(jié)果:
  1.DKK1抑制巨噬細(xì)胞

12、內(nèi)脂質(zhì)沉積
  2.Wnt通路參與DKK1對巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積的抑制作用
  3.DKK1通過抑制經(jīng)典Wnt通路下調(diào)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)受體LOX-1的表達(dá)
  4.DKK1通過活化STAT3通路上調(diào)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)受體ABCA/G1的表達(dá)
  結(jié)論:
  (1) DKK1能夠抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積;
  (2) DKK1通過抑制Wnt/β-catenin通路下調(diào)LOX-1的表達(dá);
  (3) DKK1通過活

13、化STAT3通路上調(diào)ABCA/G1的表達(dá)。
  第三部分 DKK1對巨噬細(xì)胞自噬水平的影響及其調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用
  研究背景:
  自噬(Autophagy)是真核生物進(jìn)化過程中相對保守的生命現(xiàn)象,是指細(xì)胞利用溶酶體水解酶水解細(xì)胞內(nèi)容物的過程,分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。巨自噬是指在饑餓等環(huán)境因素刺激下,胞質(zhì)內(nèi)形成雙層膜結(jié)構(gòu)將胞質(zhì)內(nèi)容物包裹運(yùn)送至溶酶體被水解酶降解的過程;而微自噬是指溶酶體直接吞噬胞質(zhì)內(nèi)容

14、物清除的現(xiàn)象;分子伴侶介導(dǎo)的自噬,是指在分子伴侶的協(xié)助下,胞內(nèi)容物被運(yùn)送至溶酶體降解的現(xiàn)象。
  研究表明,Wnt/β-catenin通路對于基礎(chǔ)狀態(tài)和應(yīng)激狀態(tài)下的自噬水平均起到負(fù)調(diào)控的作用;而自噬活化時(shí)β-catenin能夠發(fā)生自噬性降解來抑制Wnt通路,形成一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)。然而自噬在DKK1對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著的作用尚未見報(bào)道。
  研究目的:
  (1)明確DKK1對巨噬細(xì)胞中自噬水平的影響;
  

15、(2)明確自噬水平的改變是否參與DKK1對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。
  研究方法:
  1.細(xì)胞培養(yǎng)
  本實(shí)驗(yàn)使用單核/巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)胞。將THP-1細(xì)胞種板后,以PMA誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀?br>  2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
  DKK1 siRNA、ATG5 siRNA和Negative control siRNA均由上海吉瑪公司合成,對細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染步驟按照Lipo-2000說明書進(jìn)行。
  

16、3.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)
  給予不同刺激后RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白,煮沸,SDS-PAGE電泳,按照對應(yīng)的分子量切膠,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,封閉,4℃一抗孵育過夜,洗膜,室溫二抗孵育1小時(shí)20分鐘,洗膜,化學(xué)發(fā)光法發(fā)光,分析蛋白條帶灰度。
  4.巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測
  給予不同刺激后,加入ac-LDL刺激過夜,4%甲醛固定30分鐘,油紅O工作液染色10分鐘,洗去浮色,蘇木素染核2分鐘,鹽酸酒精去分化1

17、5秒,置于清水中返藍(lán)7分鐘后,甘油明膠封片,拍照并統(tǒng)計(jì)胞質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)沉積情況。細(xì)胞給予不同刺激后,加入Dil-ac-LDL避光孵育過夜,棄去培養(yǎng)基,1×PBS沖洗細(xì)胞,4%甲醛固定,1×PBS沖洗細(xì)胞,DAPI染核8分鐘,1×PBS沖洗細(xì)胞,抗熒光淬滅劑封片,共聚焦顯微鏡549nm激發(fā)波長下檢測熒光強(qiáng)度,以檢測巨噬細(xì)胞對Dil-ac-LDL的吞噬能力。
  研究結(jié)果:
  1.DKK1上調(diào)巨噬細(xì)胞中自噬的水平
  2.D

18、KK1通過上調(diào)自噬水平來抑制巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積
  3.DKK1通過上調(diào)自噬水平來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)受體的表達(dá)
  4.DKK1能夠通過自噬化降解下調(diào)巨噬細(xì)胞中的β-catenin的水平
  結(jié)論:
  (1) DKK1能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞的自噬水平來抑制脂質(zhì)代謝;
  (2) DKK1通過自噬調(diào)節(jié)脂質(zhì)受體LOX-1和ABCA/G1的表達(dá)。
  (3) DKK1能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞中β-catenin的自噬化

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