MiR-218通過RAB6C對(duì)腎透明細(xì)胞癌調(diào)控作用的研究.pdf

1、研究背景:腎癌是常見的泌尿系腫瘤,早期腎癌沒有典型的癥狀和表現(xiàn),臨床上缺乏早期診斷預(yù)測和判斷預(yù)后的標(biāo)志物,而復(fù)發(fā)性及晚期轉(zhuǎn)移性腎癌的治療效果差,手術(shù)以外的放化療等輔助治療效果不明顯。目前臨床上需要一種新的生物學(xué)標(biāo)志物,能夠?qū)δI臟腫瘤進(jìn)行早期診斷和預(yù)后判斷,并有可能作為腫瘤治療的新靶點(diǎn),提高腎癌,特別是晚期腎癌的治療效果,延長生存期,使患者受益。
　　研究目的:本課題擬通過對(duì)miR-218在腎癌腫瘤中的特異表達(dá),以及對(duì)腎癌細(xì)胞調(diào)控作

2、用的研究,明確miR-218在腎臟腫瘤中的作用機(jī)制,為腎癌的診治提供新的思路。
　　方法:
　　1.收集腎癌標(biāo)本,利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)新鮮腎癌組織及癌旁組織的miR-218表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證,以明確miR-218在腎癌組織的表達(dá)情況。
　　2.應(yīng)用pcDNA3.1(+)載體,以人Has-miR-218設(shè)計(jì)引物,PCR法進(jìn)行擴(kuò)增,再與載體相連接,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒,并在腎癌細(xì)胞株中驗(yàn)證其效果。
　　3.使用前期合成的

3、質(zhì)粒,在體外研究中選擇合適腎癌細(xì)胞株,進(jìn)行轉(zhuǎn)染,調(diào)控在腎癌細(xì)胞株中miR-218的表達(dá)水平,研究miR-218對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,如增殖、侵襲、凋亡能力的改變等情況。
　　4.采用生物信息學(xué)方法對(duì)靶向基因進(jìn)行預(yù)測,篩選出候選靶向基因,利用設(shè)計(jì)的引物將目的基因連接入熒光報(bào)告載體,轉(zhuǎn)染至腎癌細(xì)胞株內(nèi),測定細(xì)胞裂解后的熒光表達(dá)量,并使用Western blot方法測定蛋白水平的表達(dá)變化,驗(yàn)證miR-218對(duì)靶向基因的調(diào)控作用,進(jìn)

4、一步明確調(diào)控的通路。
　　5.在動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證,miR-218通過RAB6C對(duì)腎細(xì)胞癌的調(diào)控作用,以及上調(diào)miR-218的表達(dá)水平對(duì)腎癌腫瘤的抑制作用。
　　結(jié)果:
　　1.采用PCR方法對(duì)腎癌及癌旁組織標(biāo)本的miR-218的表達(dá)量進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)在腎癌組織中,miR-218的表達(dá)水平較正常組織呈現(xiàn)明顯的低表達(dá),這提示了miR-218在腎細(xì)胞癌中可能是一種抑癌基因;
　　2.成功構(gòu)建了miR-218表達(dá)質(zhì)粒pcDNA

5、3.1-miR-218,鑒定檢測符合設(shè)計(jì)要求,該載體可以應(yīng)用于miR-218功能及作用機(jī)制的研究;
　　3.應(yīng)用miR-218表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染至腎癌細(xì)胞株中,上調(diào)細(xì)胞株中miR-218的表達(dá)水平,使用一系列標(biāo)準(zhǔn)體外腫瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-218的表達(dá)水平能夠明顯抑制腎癌腫瘤細(xì)胞的生長,減弱其增殖和侵襲能力,增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡水平;
　　4.生物信息學(xué)預(yù)測 miR-218的靶向基因之一是 RAB6C,通過熒光素檢測驗(yàn)證RA

6、B6C確實(shí)是miR-218的靶向調(diào)控因子,Western blot結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染miR-218的腫瘤細(xì)胞中RAB6C的表達(dá)明顯降低,說明miR-218通過RAB6C進(jìn)行調(diào)控,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲,促進(jìn)其凋亡;
　　5.動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),上調(diào)miR-218的表達(dá)水平,RAB6C表達(dá)水平降低,可以抑制腎癌腫瘤的生長。
　　結(jié)論:通過上述實(shí)驗(yàn),我們首次獲知,miR-218對(duì)腎癌細(xì)胞的生長、增殖、侵襲和凋亡具有調(diào)控作用,其調(diào)控作