抗癌蛋白AC-01對(duì)大腸癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)期望通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，深入探討抗癌蛋白AC-01對(duì)大腸腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性所產(chǎn)生的影響，以及產(chǎn)生該影響的生物機(jī)制，為AC-01應(yīng)用于大腸癌的生物治療提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　第一部分人大腸癌細(xì)胞中AC-01的表達(dá)及其與STAT3的關(guān)系
　　目的:
　　臨床收集人大腸癌標(biāo)本，研究AC-01在大腸癌中的表達(dá)及作用。
　　方法:
　　在前期研究基礎(chǔ)提示STAT3為促癌基因的基礎(chǔ)上，首先利用前期所制備的多克隆抗體，

2、首先對(duì)該蛋白在大腸組織內(nèi)的表達(dá)特征進(jìn)行了觀察，免疫組化技術(shù)檢測(cè)AC-01在大腸組織中的分布及表達(dá)。臨床收集人大腸癌組織標(biāo)本，標(biāo)本分為八組，每組分腫瘤與癌旁組織，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)八組中AC-01及STAT3、pSTAT3的蛋白表達(dá)并進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:
　　免疫組化技術(shù)檢測(cè)AC-01在大腸組織中的分布及表達(dá)，結(jié)果提示AC-01蛋白在人的正常大腸組織存在表達(dá)。人大腸癌組織標(biāo)本中，腫瘤組織中AC-01蛋白表達(dá)低

3、于癌旁組織。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)研究表明:①人大腸腫瘤中AC-01蛋白表達(dá)水平低于正常組織;②人大腸腫瘤中STAT3、pSTAT3蛋白表達(dá)水平均高于正常組織。③人大腸腫瘤中AC-01蛋白表達(dá)水平與pSTAT3蛋白表達(dá)水平為負(fù)相關(guān)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合以上，根據(jù)STAT3為促癌基因的前期研究結(jié)果，由此推測(cè)AC-01為抗癌蛋白。
　　第二部分構(gòu)建并鑒定載體及穩(wěn)定細(xì)胞株
　　實(shí)驗(yàn)一 構(gòu)建靶向AC-01的過表達(dá)載體及

4、shRNA表達(dá)載體
　　目的:
　　體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞株，提取質(zhì)粒，構(gòu)建過表達(dá)pBabe-puro-AC-01載體，同時(shí)設(shè)計(jì)并構(gòu)建以AC-01為靶基因的pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表達(dá)載體，最終構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞株，根據(jù)NCBI提供的AC-01基因序列(NCBI登錄號(hào)為XM006714717)進(jìn)行分析，以攜帶AC-01基因的質(zhì)粒為模板

5、，通過PCR擴(kuò)增出AC-01基因的編碼序列，構(gòu)建了pBabe-puro-AC-01過表達(dá)載體。
　　結(jié)果:
　　所得質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序鑒定，證實(shí)了干擾質(zhì)粒中含有目的基因的序列，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　實(shí)驗(yàn)二 構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株并鑒定
　　目的:
　　篩選最高效序列AC-01/RNAi，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞株，篩選保留穩(wěn)定細(xì)胞株，鑒定穩(wěn)定細(xì)胞株并檢測(cè)AC-01基因表達(dá)。
　　方法:
　　使

6、用脂質(zhì)體法將pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為4組，分析轉(zhuǎn)染后的效果。
　　結(jié)果:
　　結(jié)合柱狀圖顯示AC-01/RNAi-1組的AC-01蛋白表達(dá)最低，因此認(rèn)為AC-01/RNAi-1組序列效果最佳,LOVO-AC-01組的AC-01蛋白表達(dá)升高，LOVO-AC-01/RNAi組的AC-01蛋白表達(dá)降低。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建過表達(dá)pBab

7、e-puro-AC-01載體及pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表達(dá)載體，篩選得到最高效序列AC-01/RNAi-1質(zhì)粒，最終構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株，并成功驗(yàn)證。
　　第三部分AC-01對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　目的:
　　探討AC-01對(duì)人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞增殖、分化、凋亡及侵襲性的影響。
　　方法:
　　將AC-01質(zhì)粒及AC-01/RNAi-1質(zhì)粒通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞，分

8、為L(zhǎng)OVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四組。
　　結(jié)果:
　　AC-01質(zhì)粒及AC-01/RNAi-1質(zhì)粒成功通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞，分為L(zhǎng)OVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四組，
　?、偌す夤簿劢褂^察轉(zhuǎn)染AC-01陽(yáng)性細(xì)胞，與周圍對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞核顯著減小;AC-01轉(zhuǎn)染細(xì)

9、胞表現(xiàn)為分化具有更多的突起，隨AC-01重組蛋白濃度的增加，大腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著下降。
　?、贛TT法檢測(cè)結(jié)果表明:四組中OD平均值有顯著性差異(H=12.12，P=0.007)，其相對(duì)增殖率亦有顯著性差異(H=12.00，P=0.0074)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)圖顯示LOVO-AC-01組中LOVO細(xì)胞增殖強(qiáng)度及速度均減弱，而LOVO-AC-01/RNAi組中LOVO細(xì)胞增殖強(qiáng)度及速度均增強(qiáng);
　?、矍忠u實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

10、明:四組中侵襲細(xì)胞數(shù)有顯著性差異(H=9.5848，P=0.0224＜0.05)。根據(jù)柱狀圖顯示LOVO-AC-01組中LOVO侵襲細(xì)胞數(shù)減少，而LOVO-AC-01/RNAi組中LOVO侵襲細(xì)胞數(shù)增加。
　　④劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:LOVO-AC-01組的細(xì)胞愈合率則弱于其他三組，LOVO-AC-01/RNAi組的細(xì)胞愈合率強(qiáng)于其他三組。
　?、?D-Culture實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:LOVO-vector組及LOVO-scramb

11、le組中LOVO細(xì)胞變化不明顯，LOVO-AC-01組的LOVO細(xì)胞表面觸角明顯收縮，表面變得平滑，LOVO-AC-01/RNAi組的細(xì)胞表面觸角明顯延長(zhǎng)、增多，表面變得更加凹凸不平。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)研究表明:①AC-01蛋白可以特異性地抑制癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，同時(shí)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，且效果顯著;②通過特異性沉默AC-01基因表達(dá)，可以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其侵襲能力，且效果顯著;③AC-01對(duì)大腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞

12、增殖的抑制作用具有劑量依賴性。④AC-01蛋白是一種抗癌蛋白，可能成為大腸癌臨床不良預(yù)后的一種分子標(biāo)志，甚至成為大腸癌治療的靶目標(biāo)。
　　第四部分AC-01對(duì)大腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制研究
　　目的:
　　探討AC-01通過調(diào)節(jié)大腸癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響LOVO細(xì)胞的存活、腫瘤演進(jìn)、血管形成及凋亡的機(jī)制。
　　方法:
　　由于該蛋白的分布特征，我們推測(cè)該蛋白的表達(dá)可能與大腸癌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。因此，我們利用經(jīng)典

13、的衣霉素(Tunicamycin)誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，對(duì)應(yīng)激條件下該蛋白的表達(dá)特征進(jìn)行了觀察，檢測(cè)AC-01蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRp78、GADD的表達(dá)，了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與AC-01蛋白的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　Western-blot檢測(cè)結(jié)果提示:四組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α、cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表達(dá)有顯著性差異(均P＜0.05)，根據(jù)柱狀圖顯示

14、LOVO-AC-01組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α、cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表達(dá)均下調(diào)，而stat3、p-stat3表達(dá)增高;LOVO-AC-01/RNA組中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α、cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表達(dá)均增強(qiáng)，而stat3、p-stat3表達(dá)下降。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)研究表明:①

15、AC-01蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)，可能是抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的損傷保護(hù)性蛋白;②AC-01蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（PERK-eIF2A通路、ATF6通路和IRE1-XBP1通路），從而影響大腸癌LOVO細(xì)胞的存活、腫瘤演進(jìn)及凋亡機(jī)制。③AC-01進(jìn)一步抑制stat3、p-stat3及其相關(guān)蛋白MMP2、MMP9，從而影響大腸癌LoVo細(xì)胞的增殖及腫瘤血管形成。
　　第五部分小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AC-01對(duì)大腸癌細(xì)胞的影響

16、r>　　目的:
　　通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討AC-01對(duì)大腸癌細(xì)胞的影響。
　　方法:
　　分為L(zhǎng)OVO-vector接種、LOVO-AC-01接種、LOVO-scramble接種、LOVO-AC-01/RNAi接種組。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染chickenB-actin-RFP-NEO表達(dá)載體。裸鼠腫瘤細(xì)胞異種移植試驗(yàn):雄性BALB/c裸小鼠皮下注射接種目標(biāo)細(xì)胞，10毫克/公斤，每三天1次。腫瘤體積由長(zhǎng)度(L)×寬度(W)2×0.5計(jì)算

17、，用滑動(dòng)卡尺測(cè)量和計(jì)算，自第七天后每三天記錄1次，40天后小鼠處以安樂死，腫瘤稱重，記錄數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　隨著時(shí)間和組別對(duì)于腫瘤體積都是有影響的，這種影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.0001)，組別和時(shí)間有交互作用。四組間，腫瘤重量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0295)。根據(jù)柱狀圖顯示，與對(duì)照組比較，LOVO-AC-01接種組中腫瘤生長(zhǎng)速度下降，腫瘤的體積、重量均減少;而且LOVO-AC-01/RNAi接種組中腫瘤生長(zhǎng)速度加