栝樓抗腫瘤活性蛋白的分離純化及誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、大腸癌（CRC）是常見的消化道惡性腫瘤。盡管在過去幾十年中，大腸癌治療已經(jīng)有了相當(dāng)大的進(jìn)步，但是大腸癌的死亡率仍然很高。在世界范圍內(nèi)，大腸癌是癌癥死亡的主要原因之一。目前化療是治療大腸癌最常用的方法之一，然而，許多化療藥物對(duì)人體有極大的毒副作用，從而限制了其臨床的應(yīng)用。許多研究報(bào)道植物來源的抗腫瘤活性蛋白具有低毒和低副作用的優(yōu)點(diǎn)，是一種極具潛力的抗腫瘤藥物。栝樓（Trichosanthes kirilowii）是葫蘆科栝樓屬的一種多年生

2、纏繞性藤本植物。在中國(guó)，栝樓種子是一種可以食用的受歡迎的小吃，而且在古代東方已經(jīng)廣泛作為民間藥物，是歷史悠久的常用中藥材。栝樓中的許多生物活性成分：石榴酸、三萜類化合物等已經(jīng)被報(bào)道具有良好的調(diào)節(jié)脂類代謝，抵制炎癥及降低葡萄糖的活性等功能。已有報(bào)道栝樓煎劑在體外有抑制癌細(xì)胞增殖的活性且其抑制效果與劑量存在正相關(guān)。栝樓根來源的天花粉蛋白也被報(bào)道具有抗腫瘤活性。但是關(guān)于栝樓果實(shí)的的抗腫瘤活性成分報(bào)道較少。本研究擬從栝樓果實(shí)中分離純化出一種抗腫

3、瘤活性蛋白，并對(duì)其誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行研究。主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾部分：
　　第一部分采用磷酸鹽緩沖液抽提、丙酮沉淀、飽和硫酸銨沉淀，Q-陰離子層析，S-200凝膠層析并結(jié)合細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)（MTT法），從栝樓果實(shí)中分離純化得到單一的抗腫瘤活性蛋白，將其命名為TKP。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，TKP與羅漢果屬黃瓜素同源性較高，其分子質(zhì)量約為46 kD。進(jìn)一步對(duì)TKP進(jìn)行了酶活性鑒定，結(jié)果顯示，PMSF（絲氨酸蛋白酶抑制劑）明顯抑制了T

4、KP的酶活性，表明TKP是一種絲氨酸蛋白酶。
　　第二部分用TKP分別處理大腸癌細(xì)胞（DLD1、HCT116、和SW620）和腸正常細(xì)胞（NCM460），檢測(cè)TKP對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TKP明顯的抑制了大腸癌細(xì)胞生存活力，但對(duì)腸正常細(xì)胞的生存活性沒有明顯的影響；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TKP抑制了大腸癌細(xì)胞的增殖。DAPI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，TKP明顯誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡。JC-1染色結(jié)果顯示，TKP

5、引起了大腸癌細(xì)胞線粒體膜電位的降低。Western印跡結(jié)果顯示， TKP處理大腸癌細(xì)胞后， Cytochrome c、Bax、Activated-caspase-9和Activated-caspase-3的蛋白水平明顯上調(diào)， Bcl-2的蛋白水平明顯下調(diào)。上述結(jié)果表明，TKP誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞凋亡是通過線粒體凋亡途徑。
　　第三部分用TKP處理大腸癌細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。Western印跡結(jié)果表明T

6、KP處理提高了p-ERK1/2的蛋白水平，但是對(duì)p-JNK和p-p38沒有明顯的影響。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)TKP處理降低了p-AKT的蛋白水平，對(duì)AKT的表達(dá)沒有明顯影響。這些結(jié)果表明，TKP處理激活MAPK/ERK1/2信號(hào)通路并抑制PI3K/AKT信號(hào)通路。為了揭示MAPK/ERK1/2信號(hào)通路在TKP誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡中的作用，用MAPK/ERK1/2信號(hào)通路抑制劑PD98059處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD98059明顯抑制TKP對(duì)ERK1

7、/2磷酸化的誘導(dǎo)，但是進(jìn)一步加強(qiáng)了TKP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，MAPK/ERK1/2信號(hào)通路不參與TKP誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步用 PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑 LY294002和激活劑 IGF-1檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LY294002進(jìn)一步降低了TKP誘導(dǎo)的p-AKT蛋白水平的下調(diào)，增強(qiáng)了TKP誘導(dǎo)的Cytochrome c、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白水平的上調(diào)和Bcl-2

8、蛋白水平的下調(diào)。與此相一致，LY294002加劇TKP誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的降低、細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位的降低。激活劑IGF-1處理后，TKP誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低和凋亡被抑制。以上結(jié)果表明，TKP通過PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡。
　　綜上所述，本研究從栝樓果實(shí)中分離純化得到單一抗腫瘤活性蛋白TKP。TKP能明顯抑制大腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)TKP通過PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體依賴的凋亡途徑誘導(dǎo)大腸