抗環(huán)瓜氨酸肽四價(jià)小分子抗體的構(gòu)建、可溶性表達(dá)與鑒定.pdf

1、目的：通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建抗環(huán)胍氨酸肽四價(jià)小分子抗體（TeAb-anti-CCP-ScFv-P53），并進(jìn)行可溶性表達(dá)及鑒定。
　　方法：（1）重疊PCR連接抗CCP-ScFv與HSA-P53基因片段，構(gòu)建TeAb-anti-CCP-ScFv-P53目的片段。將目的片段分別轉(zhuǎn)入以胞內(nèi)表達(dá)為主的pET28a系統(tǒng)；以周質(zhì)表達(dá)為主的pET22k、pAD22k系統(tǒng)；以胞內(nèi)可溶表達(dá)為主的pETSumo、pETGST、pETNus、p

2、MBPc系統(tǒng)；以培養(yǎng)基可溶表達(dá)為主的pMBPp系統(tǒng)。菌落PCR擴(kuò)增，抽提基因組DNA測(cè)序鑒定。（2）將測(cè)序正確的陽性克隆轉(zhuǎn)入BL21(DH3)感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)可溶表達(dá)，SDS-PAGE凝膠及Western blot鑒定目標(biāo)蛋白表達(dá)情況，選取有可溶表達(dá)的系統(tǒng)擴(kuò)大培養(yǎng)、鎳層析柱親和純化。（3）ELISA評(píng)價(jià)其特異性；非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定其親和常數(shù)(Ka)；間接免疫熒光法鑒定其在體活性。
　　結(jié)果：（1）瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)目的

3、片段構(gòu)建成功；質(zhì)粒DNA測(cè)序表明載體與目的片段連接正確。（2）SDS-PAGE凝膠及Western blot結(jié)果顯示pETGST及pMBPp系統(tǒng)未見表達(dá)；pET28a、pET22K及pAD22K系統(tǒng)尚有蛋白表達(dá)，但主要在包涵體內(nèi)，可溶性表達(dá)少，未能純化出足量蛋白用于下一步試驗(yàn)；pSumo融合表達(dá)系統(tǒng)能夠純化到較高的純度，但使用Sumo相應(yīng)酶無法切除融合標(biāo)簽；pNus系統(tǒng)細(xì)胞裂解后形成高聚體，無法通過鎳層析柱親和層析得到富集；pMBPc系

4、統(tǒng)獲得了一定量的可溶表達(dá)，純化成功。選取pMBPc系統(tǒng)進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。（3）可溶性TeAb-anti-CCP-ScFv-P53特異性與CCPII的結(jié)合，明顯高于SSA、SSB、Sm、snRNP和RF；可溶性TeAb-anti-CCP-ScFv-P53親和常數(shù)Ka≌3.61×108-4.28×109M-1；使用間接免疫熒光法以AKA、APF為底物證實(shí)其具有在體活性。
　　結(jié)論：（1）TeAb-anti-CCP-ScFv-P53可在p