鐵離子調(diào)節(jié)革蘭氏陰性菌外膜蛋白OmpW抗宿主氧化應(yīng)激作用及機制的研究.pdf

1、革蘭氏陰性菌是造成感染性疾病的主要致病菌,其少數(shù)的外膜蛋白是毒力因子,有抵抗宿主免疫的作用,在毒力發(fā)揮和感染宿主的過程中發(fā)揮極其重要的作用。
　　 動物的先天性免疫是抵抗病菌感染的主要方式,而這種免疫作用的維持依賴于鐵離子介導(dǎo)的芬頓(Fenton)反應(yīng)。機體通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生低水平的自由基,進而造成氧化應(yīng)激環(huán)境,殺死并清除入侵的病原菌,保證機體的健康。一旦鐵代謝失調(diào)造成機體內(nèi)游離的鐵離子過多,不但會促進入侵的細菌生長、毒力增強,還

2、會產(chǎn)生大量的自由基,如果機體由于生理或病理原因不能及時清除掉這些產(chǎn)生的自由基而使其處于較高水平,就會形成氧化應(yīng)激,損傷正常細胞,影響機體的正常代謝,造成各種疾病,嚴重時會危及生命的安全。此外少數(shù)外膜蛋白可以激活宿主免疫系統(tǒng),保護生物體健康。具有免疫原性的OmpW是大多數(shù)革蘭氏陰性菌外膜蛋白家族成員之一,也是革蘭氏陰性菌毒力因子之一,與細菌對宿主的感染密切相關(guān)。鑒于鐵離子和氧化應(yīng)激在免疫及細菌感染方面的重要作用,從細菌抵抗宿主免疫這一角度

3、來探討感染與免疫的關(guān)系,揭示感染性疾病新的發(fā)病機制就顯得尤為重要。
　　 本課題從氧化應(yīng)激的角度探索鐵離子對革蘭氏陰性菌外膜蛋白OmpW表達的影響,深入理解細菌與宿主氧化應(yīng)激之間的相互作用,進而為革蘭氏陰性菌新的致病機制的研究提供理論基礎(chǔ),對感染性疾病的控制、治療具有重要的理論和實踐意義。本課題首先構(gòu)建pLLP-OmpA-ompW重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12感受態(tài)細胞得到外膜上高表達OmoW蛋白的高表達菌(以下簡稱高表達菌)。同

4、時通過構(gòu)建載體和轉(zhuǎn)化的手段獲得高表達OmpW蛋白的胞漿高表達菌,提取并純化該蛋白用于免疫小鼠以制備抗血清。再次通過鐵離子限制條件下,正常菌(K12菌)、敲除菌、高表達菌在氧化應(yīng)激環(huán)境中存活率的變化來反映細菌抗氧化應(yīng)激作用的強弱,并測定這3種菌在同等時間內(nèi)細菌細胞對二價鐵離子攝入的差異。最后通過Western blot反映鐵離子和氧化應(yīng)激對K12菌OmpW蛋白表達的影響。
　　 本課題的研究表明:3種菌在正常培養(yǎng)時高表達菌對H2O

5、2氧化應(yīng)激的耐受能力較強,K12菌次之,敲除菌最弱,在鐵離子限制處理的條件下這3種菌耐受H2O2氧化應(yīng)激的總體趨勢基本沒變,但略有下降。正常菌在鐵離子限制條件下對H2O2氧化應(yīng)激耐受能力降低。細菌對鐵離子攝入實驗中,高表達菌攝入的鐵離子較多,而敲除菌對鐵離子的攝入最少。鐵離子和H2O2氧化應(yīng)激可以調(diào)節(jié)細菌OmpW蛋白的表達量,通過Western blot實驗證實,K12菌在鐵離子限制的條件下沒有檢測到OmpW蛋白表達,而過量的鐵離子或H