整合子相關的革蘭陰性菌耐藥機制研究.pdf

1、研究背景: 整合子(Integron)是存在于細菌基因組或質粒上的基因片段，具有位點特異性重組功能，且能夠識別并捕獲移動性基因盒。基因盒是整合子所攜帶的基因片段，常攜帶各種基因賦予整合子某方面的表型，其中很多是耐藥基因。整合子本身不能轉移，但其攜帶的耐藥基因盒可以通過整合酶在特異位點的酶切反應，在整合子間轉移或轉移到其他細菌基因組中。因此整合子在細菌獲得性耐藥機制中發(fā)揮了重要的作用。銅綠假單胞菌(Pseudomanos aeru

2、ginos，P.A)是醫(yī)院感染常見的條件致病菌，且對多種抗生素存在天然和獲得性多重耐藥，其耐藥機制復雜。碳青霉烯類抗生素是治療難治性銅綠假單胞菌感染的有效選擇，但由于抗生素的不合理不規(guī)范使用，出現(xiàn)了很多耐碳青霉烯類的銅綠假單胞菌。因此研究碳青霉烯類抗生素的耐藥機制對于臨床合理用藥具有很大的指導意義。 實驗目的: 研究Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子在革蘭陰性菌中的分布，及其攜帶的耐藥基因盒。以銅綠假單胞菌為例，研究金屬酶、整合子及外膜

3、蛋白在多重耐藥革蘭陰性菌中所起的作用，并探索三者的相關性。為指導臨床抗生素使用提供理論依據(jù)。 實驗方法和結果: 1.革蘭陰性菌中整合子的鑒定及其耐藥基因盒的種類 收集中南大學湘雅三醫(yī)院2006年9月到2007年6月，多重耐藥革蘭陰性菌183株。根據(jù)各型整合酶和整合子已知基因序列設計引物，進行PCR初篩并分型整合子；PCR擴增整合子可變區(qū)，限制性片段多態(tài)性分析(RFLP)鑒定整合子可變區(qū)的同一性；PCR產(chǎn)物測序分析

4、整合子所攜帶的基因盒種類。 結果：Ⅰ型整合子的陽性率為54.6％(100/183)。發(fā)現(xiàn)四種整合子結構，分別是blaVIM-2-aacA-Ib-aadA2-qacE，dfrh12-aadA2-aacE-blaCTX-M-2，dhfrX Ⅱ-orfF-aadA2，dhfrX Ⅱ-orfF-aadA2-sull。分別攜帶編碼碳青酶烯類、β-內酰胺類、氨基糖苷類及磺胺類耐藥基因。無Ⅱ、Ⅲ類整合子檢出。 2.耐碳青酶烯銅綠假單胞

5、菌的耐藥機制分析 選取42株銅綠假單胞菌，用EDTA協(xié)同實驗分析各菌株所產(chǎn)金屬β-內酰胺酶(MBL)；PCR擴增其整合酶和整合子基因，測序確定其耐藥基因盒；RT-PCR半定量測定外排泵結構基因mexA的表達水平；Western Blot測定外排泵結構蛋白MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN的表達水平，以分析銅綠假單胞菌的耐碳青霉烯類抗生素的機制，及各機制之間的相關性。 結果：產(chǎn)金屬β-內酰胺酶