含低氧誘導(dǎo)啟動子和質(zhì)粒分配序列的革蘭氏陰性菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、在該論文工作中,利用質(zhì)粒pSC101的par位點(partiton region)與透明顫菌血紅蛋白基因啟動子(P<,vgb>)以及透明顫菌血紅蛋白基因操縱子(vgb)分別組合,在大腸桿菌質(zhì)粒pKK223-3的基礎(chǔ)上構(gòu)建了四個各具特點的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒:pKVp(P<,vgb>)、pKVpP(P<,vgb>、par region)、pKVpV(P<,vgb>、vgb operon)、pKVpPV(P<,vgb>、par region、v

2、gb operon)可滿足大腸桿菌中蛋白表達(dá)的不同要求;利用優(yōu)化后的同源重組技術(shù),將E. coli JM83/E.coli JM101分別改造成為整合有透明顫菌血紅蛋白基因操縱子的重組菌E. coli VI/E.coli Ⅶ;通過將透明顫菌血紅蛋白基因啟動子以及透明顫菌血紅蛋白基因操縱子與革蘭氏陰性菌廣泛宿主載體pBBRlMCSl和pBBRlMCS2組合,構(gòu)建了兩個抗性不同的革蘭氏陰性菌廣泛宿主低溶氧誘導(dǎo)表達(dá)載體.結(jié)合文獻(xiàn)報道,該工作利

3、用增強型綠色熒光蛋白(eGFP)、甲苯雙加氧酶(TOD)、聚羥基丁酸合成酶(phaCAB)作為目的表達(dá)蛋白,對該系統(tǒng)中不同的表達(dá)載體進(jìn)行了檢測.搖瓶實驗結(jié)果表明在所有的表達(dá)系統(tǒng)中,透明顫菌血紅蛋白在限氧條件下的表達(dá)量要高于富氧條件下.在整合有vgb操縱子的重組大腸桿菌Ⅵ/Ⅶ中,限氧條件下VHb的表達(dá)量大約是相同條件下重組菌E. coli JM83(pKVpPV)的1/4.同時,增強型綠色熒光蛋白和甲苯雙加氧酶的介入并沒有改變這兩種條件下

4、透明顫菌血紅蛋白表達(dá)量的比例.含有質(zhì)粒pKVp-E(P<,vgb>,egfp)或pKVpP-E(P<,vgb>,par,egfp)的重組大腸桿菌在24小時培養(yǎng)中,在厭氧、無抗生素條件下增強型綠色熒光蛋白的表達(dá)量至少是相對應(yīng)的在富氧條件下的兩倍.在表達(dá)增強型綠色熒光蛋白時檢測到,與tac啟動子相比,P<,vgb>不需要化學(xué)誘導(dǎo)劑,而且當(dāng)兩者均處于誘導(dǎo)狀態(tài)時,后者表現(xiàn)出更高的表達(dá)強度和誘導(dǎo)效率,后者是前者的1.7倍.重組菌E.coli JM