含雙病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子植物安全表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化及表達(dá)活性分析.pdf

1、植物抗病基因工程是植物抗病育種常用的工具之一,利用病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)功能基因以提高植物的抗病性比組成型啟動(dòng)子有明顯的優(yōu)勢(shì)。植物在環(huán)境中經(jīng)常同時(shí)遭受不同病原物的為害,因而植物需要廣譜的抗病性。由于單個(gè)啟動(dòng)子受誘導(dǎo)因子譜的限制,利用單一病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)功能基因的表達(dá),對(duì)入侵病原物的打擊范圍是有限的。 本研究把兩個(gè)具有高度病原物誘導(dǎo)特異性的啟動(dòng)子EAS4和hsr203J構(gòu)建到同一個(gè)植物表達(dá)載體上,通過(guò)對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化,分析轉(zhuǎn)基因

2、植株中啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)活性,說(shuō)明串聯(lián)兩個(gè)啟動(dòng)子,可以增加誘導(dǎo)因子的范圍,擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因植物的抗病譜,這對(duì)于抵抗幾種病原物的侵染尤其有重要意義。同時(shí),出于對(duì)轉(zhuǎn)基因安全性的考慮,利用兩個(gè)T-DNA邊界將目的基因與抗生素抗性基因分開(kāi),通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株的后代自交分離,獲得了只含目標(biāo)基因而不含抗生素標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。所得結(jié)果如下： 1、構(gòu)建了含雙病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體,并對(duì)煙草進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化 以pCAMBIA2301為基本構(gòu)架,

3、選用兩個(gè)來(lái)自煙草的、具有高度病原物誘導(dǎo)特異性的啟動(dòng)子EAS4和hsr203J替換驅(qū)動(dòng)uidA(報(bào)告基因GUS)基因表達(dá)的CaMV 35S啟動(dòng)子。為了分析串聯(lián)的兩個(gè)啟動(dòng)子活性是否有位置效應(yīng),同時(shí)構(gòu)建啟動(dòng)子串聯(lián)次序不同的兩種植物表達(dá)載體HPl+EP2(hsr203J+EAS4+uidA)和EP1+HP2(EAS4+hsr203J+uidA),并分別以單啟動(dòng)子hsr203J和EAS4驅(qū)動(dòng)uidA為對(duì)照,構(gòu)建了四個(gè)表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)

4、轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草。對(duì)200株抗生素抗性植株進(jìn)行PCR篩選,共獲得152株P(guān)CR陽(yáng)性植株。 2、轉(zhuǎn)基因植株中啟動(dòng)子表現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)表達(dá)活性,雙啟動(dòng)子比單一啟動(dòng)子表現(xiàn)更強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá)活性 為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)活性,從RNA水平、GUS的定性、定量檢測(cè)等方面,對(duì)不同病原物誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性進(jìn)行了研究。 2.1 隨機(jī)選取30株P(guān)CR檢測(cè)呈陽(yáng)性的植株,用激發(fā)子parasiticein處理后提取誘導(dǎo)部位組織的

5、總RNA,經(jīng)RT-PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)24株(80％)獲得了與GUS基因預(yù)期大小一致的特異性片段,表明這些轉(zhuǎn)基因煙草中GUS基因經(jīng)誘導(dǎo)后可在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。 2.2 選取14株RT-PCR呈現(xiàn)陽(yáng)性的植株,分別用煙草黑脛病菌(Phytophthora nicotianea)、煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)和激發(fā)子parasiticein等誘導(dǎo)處理,經(jīng)組織化學(xué)染

6、色發(fā)現(xiàn),在檢測(cè)的植株中,除單一啟動(dòng)子ESA4不受灰霉菌誘導(dǎo)外,經(jīng)其它病原物處理的植株都不同程度地被染成藍(lán)色,而清水處理的葉片幾乎沒(méi)有顏色變化或僅有很輕微的背景色,表明,本研究所構(gòu)建4個(gè)表達(dá)載體中,啟動(dòng)子都具有病原物誘導(dǎo)表達(dá)的活性,并且,雙啟動(dòng)子較單啟動(dòng)子表現(xiàn)出更為廣泛的誘導(dǎo)譜。 2.3 為明確單、雙啟動(dòng)子是否存在誘導(dǎo)表達(dá)量的差異,用熒光法對(duì)GUS基因的誘導(dǎo)表達(dá)活性進(jìn)行了定量檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)P。nicotianea、R

7、.solanacearum和激發(fā)子parasiticein誘導(dǎo)后6h,雙啟動(dòng)子HP1+EP2的誘導(dǎo)表達(dá)活性比單啟動(dòng)子hsr203J高5.9-8.0倍,比EAS4高6.7-7.9倍；雙啟動(dòng)子EP1+HP2比單啟動(dòng)子hsr203J的誘導(dǎo)表達(dá)活性高5.0-5.7倍,比EAS4高4.7-6.5倍,雙啟動(dòng)子與單啟動(dòng)子的活性差異均達(dá)極顯著水平。雙啟動(dòng)子HP1+EP2和EP1+HP2的誘導(dǎo)表達(dá)活性也存在極顯著差異,而兩個(gè)單啟動(dòng)子HP1和EP1之間沒(méi)有

8、明顯差別。 2.4 同時(shí),用熒光法對(duì)GUS的誘導(dǎo)表達(dá)活性進(jìn)行了動(dòng)態(tài)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)雙啟動(dòng)子HP1+EP2的誘導(dǎo)表達(dá)高峰一般出現(xiàn)在誘導(dǎo)后6-10h,而雙啟動(dòng)子EP1+HP2的活性高峰一般在誘導(dǎo)后8-14h。在檢測(cè)的時(shí)間范圍內(nèi),雙啟動(dòng)子的誘導(dǎo)活性始終高于單一啟動(dòng)子。 這些結(jié)果說(shuō)明,本研究所構(gòu)建的4個(gè)載體中,啟動(dòng)子都具有病原物誘導(dǎo)表達(dá)活性,都可被多種病原物誘導(dǎo)表達(dá)。雙啟動(dòng)子不僅有更廣泛的誘導(dǎo)表達(dá)譜,而且誘導(dǎo)表達(dá)活性顯著高于單啟動(dòng)子。

9、 3、轉(zhuǎn)基因株系在T1代可以實(shí)現(xiàn)NPTII基因與功能基因uidA的自由分離,獲得不含抗生素標(biāo)記的、安全的轉(zhuǎn)基因后代 抗生素標(biāo)記是轉(zhuǎn)基因植物安全性所關(guān)注的重要內(nèi)容之一,出于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物安全性的考慮,在載體設(shè)計(jì)時(shí)引入了雙邊界序列,把卡那霉素抗性基因NPTII表達(dá)盒和uidA基因表達(dá)盒分開(kāi)在不同的T-DNA區(qū),通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株后代的自交分離,篩選獲得只含目的基因而不含NPTII的轉(zhuǎn)基因植株。 首先對(duì)14個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的T1

10、代幼苗用含卡那霉素的平板進(jìn)行了表型檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),13個(gè)株系的NPTII基因的分離比平均為2.89:1,接近3:1,表明這13個(gè)株系中NPⅢ基因可能為單拷貝插入。 為檢測(cè)NPTII基因與uidA在T1代中是否發(fā)生自由分離,從13個(gè)NPTII單拷貝株系的T1代植株中隨機(jī)選取130株,提取基因組DNA,PCR法對(duì)其N(xiāo)PTII基因和uidA基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果是：只含uidA基因的植株占被擴(kuò)增整體的20.77％,只含NPTII基因的