人毛乳頭細(xì)胞CCDC72基因的表達(dá)及啟動(dòng)子活性分析.pdf

1、毛囊是毛發(fā)的主體，是一個(gè)典型的再生系統(tǒng)，從胚胎期發(fā)生后就伴隨個(gè)體一生并周而復(fù)始地循環(huán)。毛發(fā)具有許多有益的生物學(xué)功能和重要的社會(huì)心理學(xué)作用，因毛發(fā)生長(zhǎng)異常而發(fā)生的少毛或多毛現(xiàn)象不僅影響毛發(fā)生理功能的正常發(fā)揮，而且使患者承受極大的心理壓力，影響他們的健康和生活質(zhì)量。因此，弄清毛發(fā)胚胎期發(fā)生、生長(zhǎng)周期調(diào)控機(jī)制及毛囊生長(zhǎng)期基因的表達(dá)變化，開發(fā)有效治療毛發(fā)疾病的藥物是目前毛囊生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。 位于毛囊基底部的毛乳頭是一個(gè)可誘導(dǎo)毛囊生長(zhǎng)的

2、結(jié)構(gòu)，它能發(fā)送或接受信號(hào)，從而影響毛囊的發(fā)育和周期性生長(zhǎng)。毛乳頭細(xì)胞是組成毛乳頭的唯一細(xì)胞，是胚胎期誘導(dǎo)毛囊形成和成熟毛囊完成周期性循環(huán)的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞。凝集性生長(zhǎng)是毛乳頭細(xì)胞的重要生物學(xué)特性之一，凝集性生長(zhǎng)與毛乳頭細(xì)胞的功能和分化狀態(tài)有關(guān)。但是毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的分子機(jī)制不明，同時(shí)凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)下毛乳頭細(xì)胞所表達(dá)的基因在毛囊發(fā)育和毛囊周期性生長(zhǎng)調(diào)控中的作用也少有研究。 凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)的DPC仍然保持誘導(dǎo)毛囊發(fā)生的能力。為了探索

3、哪些基因在DPC凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)下表達(dá)，篩選與DPC凝集生長(zhǎng)相關(guān)的基因，宋志強(qiáng)等通過抑制性消減雜交技術(shù)建立了人類DPC消減cDNA文庫，并從凝集生長(zhǎng)狀態(tài)的DPC篩選出一批表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)基因。CCDC72即是通過上述方法篩選出的與DPC凝集性生長(zhǎng)相關(guān)基因，它首次從CD34+造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞( CD34+ hematopoietic stem/progenitorcells，HSPC)中被分離鑒定，但功能不清。王繼文等通過RNA干擾技術(shù)

4、使CCDC72基因在DPC內(nèi)的表達(dá)下降或消失，結(jié)果顯示CCDC72表達(dá)陰性后的DPC生長(zhǎng)速度明顯減慢并失去凝集性生長(zhǎng)特性，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了顯著的改變。夏汝山等發(fā)現(xiàn)CCDC72重組蛋白能促進(jìn)高傳代DPC的增殖及DNA的合成。這些結(jié)果表明CCDC72對(duì)調(diào)節(jié)DPC生長(zhǎng)及其分化至關(guān)重要，是毛囊生長(zhǎng)期維持DPC處于功能狀態(tài)的重要基因之一。基于以上認(rèn)識(shí)，本課題擬對(duì)CCDC72基因在DPC中的基因表達(dá)、蛋白定位和啟動(dòng)子活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。 1、

5、兩步酶消化法是一種快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的分離培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞的方法。我們首先從人頭皮毛囊分離培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞，這些細(xì)胞具有周期性凝集性生長(zhǎng)特性，而且這種特性隨著傳代次數(shù)的增多而逐步喪失。 2、利用細(xì)胞免疫熒光和還原型線粒體特異性熒光探針MitoTracker Red CM-H2XRos，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)CCDC72蛋白位于胞漿內(nèi)，可能定位于線粒體上。通過熒光半定量Real-time PCR發(fā)現(xiàn)隨著DPCs傳代數(shù)的增加，CC

6、DC72基因mRNA的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，1～3代DPCs中CCDC72mRNA的表達(dá)穩(wěn)定且顯著高于4～8代，4～6代DPCs中CCDC72mRNA的表達(dá)又顯著高于第8代。 3、運(yùn)用在線軟件Cister對(duì)CCDC72基因5’端2000bp進(jìn)行啟動(dòng)子特征分析表明其5’側(cè)翼區(qū)的主要特點(diǎn)是在-200～-1bp及-1000～-600bp兩段區(qū)域間順式作用元件呈高頻分布。根據(jù)上述結(jié)果從5’端逐步缺失，成功構(gòu)建4個(gè)5’端不等，3’端平齊的啟動(dòng)子

7、熒光素酶報(bào)告基因載體，分別轉(zhuǎn)染第3代和第8代的DPCs中，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)熒光素酶表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：在第3代DPCs中，這四個(gè)不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子重組pGL3-Basic載體熒光素酶活性較pGL3-Basic空載體明顯增強(qiáng)，pGL3-B-604的熒光素酶活性最強(qiáng)。在第8代DPCs中，4個(gè)重組pGL3-Basic載體熒光素酶活性均較第3代DPCs的明顯降低，pGL3-B-1924熒光素酶活性與pGL3-Basic空載體無差異，p