miR-22下調(diào)Galectin-9參與肝癌免疫逃逸的作用研究.pdf

1、目的：通過表達(dá)水平檢測和生物信息學(xué)軟件將Galectin-9與microRNA建立聯(lián)系，驗證miR-22對Galectin-9的靶向調(diào)控作用，并研究miR-22-Galectin-9途徑對腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖凋亡情況以及細(xì)胞因子水平的影響。
　　方法：生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測Galectin-9其潛在相關(guān)microRNA，qRT-PCR和Western blot方法檢測表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染microRNA mimics和Galectin

2、-9-3’UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒對miR-22與Galectin-9的靶向調(diào)控關(guān)系進(jìn)行驗證。HepG2細(xì)胞與PBMC共培養(yǎng)，WST-1方法檢測各組HepG2細(xì)胞的增殖情況，Annexin-V-Fluos試劑盒流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞的凋亡情況，qRT-PCR檢測細(xì)胞因子IL-2和IFN-γmRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-22可能對Galectin-9存在靶向調(diào)控作用，且肝癌細(xì)胞中Galectin-9表達(dá)

3、升高，miR-22表達(dá)顯著降低。miR-22通過直接與Galectin-93’UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)Galectin-9的表達(dá)。miR-22-Galectin-9途徑影響共培養(yǎng)體系中腫瘤細(xì)胞增殖和淋巴細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可能參與肝癌細(xì)胞的免疫逃逸過程。
　　結(jié)論：miR-22下調(diào)Galectin-9參與肝癌的免疫逃逸過程。
　　第一部分 Galectin-9及其潛在相關(guān)microRNA在肝癌中的表達(dá)
　　

4、目的：檢測Galectin-9在肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞中的表達(dá)水平，生物信息學(xué)軟件預(yù)測可能與其存在靶向調(diào)控關(guān)系的microRNA，并檢測它們在肝癌中的表達(dá)情況，確定重點研究靶向關(guān)系的一種microRNA。
　　方法：培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞Lo2和肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC7721，收集一定數(shù)量的細(xì)胞，提取RNA和蛋白質(zhì)，qRT-PCR和Western blot方法分別檢測Galectin-9在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。使用生物信息學(xué)

5、分析軟件miRanda（http://www.microrna.org）和TargetScan（http://www.targetscan.org/）預(yù)測可能與Galectin-9存在靶向調(diào)控關(guān)系的microRNA，選擇miR-22、296-3p、455-5p和491-5p，qRT-PCR法分別檢測它們在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。武漢協(xié)和醫(yī)院肝膽外科查閱病人臨床病例和病理參數(shù)，收集肝癌患者肝癌組織和對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，提取RNA，

6、檢測miR-22在肝癌組織中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：Galectin-9 mRNA和蛋白在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常肝細(xì)胞，尤其是在HepG2細(xì)胞表達(dá)最高。生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-22、296-3p、455-5p和491-5p可能與Galectin-9存在靶向調(diào)控關(guān)系，其中miR-22和miR-491-5p在肝癌細(xì)胞比正常肝細(xì)胞中表達(dá)低，miR-22表達(dá)差異最顯著。同時，miR-22在肝癌組織的表達(dá)水平也是明顯低于相應(yīng)的癌旁組

7、織。
　　結(jié)論：生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-22可能對Galectin-9存在靶向調(diào)控作用，且肝癌細(xì)胞中Galectin-9表達(dá)升高，miR-22表達(dá)顯著降低，為進(jìn)一步驗證兩者之間的靶向關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分 Galectin-93’UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建和miR-22對Galectin-9直接靶向調(diào)控關(guān)系的驗證
　　目的：構(gòu)建Galectin-93’UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒，驗證miR-22對Gale

8、ctin-9的靶向調(diào)控作用。
　　方法：將miR-22 mimics和Control mimics分別轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞HepG2中，24小時后，熒光顯微鏡下觀察microRNA mimics的轉(zhuǎn)染效率并qRT-PCR檢測miR-22的表達(dá)差異，同時檢測Galectin-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平，與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行對比，分析Galectin-9表達(dá)的變化?；蚬こ谭椒?gòu)建pCMV-Galectin-93’UTR野生型和變異

9、型熒光素酶報告基因質(zhì)粒，分別與miR-22 mimics和Control mimics共轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞，24小時后，使用雙熒光檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
　　結(jié)果： microRNA mimics轉(zhuǎn)染效率約60％，轉(zhuǎn)染miR-22 mimics的HepG2細(xì)胞與轉(zhuǎn)染Control mimics和未處理組相比，miR-22表達(dá)上調(diào)，Galectin-9 mRNA表達(dá)水平無明顯差異，蛋白表達(dá)明顯降低。Galectin-93

10、’UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建成功，熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)miR-22 mimics和pCMV-Galectin-93’UTR野生型質(zhì)粒的細(xì)胞中，熒光強(qiáng)度明顯較其他三組低。
　　結(jié)論：miR-22與Galectin-9存在靶向調(diào)控關(guān)系，miR-22通過直接與Galectin-93’UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)Galectin-9的表達(dá)。
　　第三部分 miR-22-Galectin-9途徑在肝癌免疫逃逸中的作用

11、
　　目的：研究miR-22-Galectin-9途徑對腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖凋亡情況以及細(xì)胞因子水平的影響，探究該途徑參與肝癌細(xì)胞免疫逃逸的分子機(jī)制。
　　方法：HepG2細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染組（陰性對照組）、轉(zhuǎn)染Galectin-9過表達(dá)載體組、轉(zhuǎn)染miR-22 mimics組和Galectin-9過表達(dá)載體-miR-22 mimics共轉(zhuǎn)組，健康供者抽取靜脈血，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液作密度梯度離心提取外周血單個核細(xì)胞（P

12、BMC），然后將上述各組HepG2細(xì)胞分別與PBMC共培養(yǎng)，48小時后WST-1方法檢測各組HepG2細(xì)胞的增殖情況，Annexin-V-Fluos試劑盒流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞的凋亡情況，qRT-PCR檢測細(xì)胞因子IL-2和IFN-γmRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染Galectin-9過表達(dá)載體組，HepG2細(xì)胞增殖數(shù)目、PBMC凋亡率高于陰性對照組，IL-2、IFN-γmRNA的表達(dá)水平低于陰性對照組。轉(zhuǎn)染miR-22 mi

13、mics組，HepG2細(xì)胞增殖數(shù)目低于陰性對照組，PBMC凋亡率與陰性對照組未發(fā)現(xiàn)明顯差異,細(xì)胞因子IL-2的表達(dá)水平與正常對照組無明顯差異，而IFN-γ的表達(dá)水平高于正常對照組。共轉(zhuǎn)Galectin-9過表達(dá)載體和miR-22 mimics組，HepG2細(xì)胞增殖數(shù)目及IL-2、IFN-γmRNA的表達(dá)水平與陰性對照組無顯著性差異，PBMC凋亡率低于轉(zhuǎn)染Galectin-9過表達(dá)載體組, IL-2的表達(dá)水平高于轉(zhuǎn)染Galectin-9過