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文檔簡(jiǎn)介
1、microRNA是最近研究發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度約為19~25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子,其通過(guò)與靶基因的3'端非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合的方法,從而調(diào)控內(nèi)源基因的表達(dá)。miRNA作為生物體生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)控基因,目前其主要研究方向是探明miRNAs與疾病的關(guān)系,尤其是miRNA與腫瘤的關(guān)系。鼻咽癌(NPC)是廣東地區(qū)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在頭頸部惡性腫瘤中占首位。鼻咽癌的發(fā)病人群以40~50歲的青壯年多見(jiàn),一旦發(fā)病對(duì)社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和家庭造成較大影響
2、。鼻咽癌原發(fā)部位隱蔽,不易觀察,且與鼻腔、鼻竇和顱內(nèi)相毗鄰,所以臨床癥狀出現(xiàn)較晚而且各異;鼻咽癌也是頭頸腫瘤中轉(zhuǎn)移率最高的。這些都導(dǎo)致了鼻咽癌常常容易被誤診或漏診,影響治療效果。因此,鼻咽癌的早期診斷和治療的研究一直是我國(guó)頭頸外科學(xué)研究的重點(diǎn)之一。目前鼻咽癌的治療還是以放射治療為主。對(duì)放療不敏感、放療后復(fù)發(fā)以及中晚期的患者,可采取化學(xué)藥物治療,但這只是輔助性治療或姑息性治療。鼻咽癌的手術(shù)治療也只在一些特殊情況下作為輔助方法采用。除了以上
3、三種常規(guī)治療,近年來(lái)也有作者嘗試應(yīng)用光動(dòng)力療法和微波熱療治療鼻咽癌,但也只能作為輔助手段。重組DNA技術(shù)的發(fā)展使腫瘤的基因治療成為可能。根據(jù)腫瘤發(fā)生機(jī)理制定的基因治療方案已成為腫瘤治療的熱點(diǎn)。早期研究者主要運(yùn)用反義核酸技術(shù)干預(yù)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá),取得了一定效果。近年來(lái),RNA干擾技術(shù)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)用,更為腫瘤的基因治療開(kāi)辟了一個(gè)新的視野。因此,意在探索性地研究miRNA在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用。
通過(guò)Targets
4、can數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),并將預(yù)測(cè)結(jié)果輸入GenMAPP軟件進(jìn)行生物學(xué)通路分析。在通路分析中,大部分靶基因富集度高的通路都涉及到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及與癌癥發(fā)生相關(guān)的通路,例如EGFR-1信號(hào)通路,MAPK信號(hào)通路等等。其中,小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最為顯著。同時(shí),Wnt信號(hào)通路的顯著性,則與我們實(shí)驗(yàn)室過(guò)去在鼻咽癌cDNA表達(dá)譜的研究結(jié)果相吻合。繼續(xù)深入研究這些差異miRNA在生物學(xué)通路中的調(diào)控作用,以及尋找與鼻咽癌發(fā)
5、生發(fā)展進(jìn)程相關(guān)的臨床診斷標(biāo)記物,則是未來(lái)努力的方向。
microRNA(miRNA)即微小RNA,是一種存在于植物和動(dòng)物基因組里的小分子RNA,約19~25nt(少數(shù)小于20nt),由一段具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)度為70~80nt的單鏈RNA前體(Pre-miRNA)剪切后形成。它通過(guò)與其目標(biāo)mRNA分子的3'端非編碼區(qū)域(3'-untranslatedregion,3'UTR)完全或非完全互補(bǔ)匹配、參與基因轉(zhuǎn)錄后水平(蛋白表達(dá)
6、)的調(diào)控,在生物體內(nèi)各種生理和病理狀態(tài)都發(fā)揮著十分重要的作用。
miRNA最早由Lee等在1993年對(duì)線蟲(Caenothabditis elegans)胚胎發(fā)育研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的一種具有調(diào)控功能的非編碼RNA。首先,miRNA基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Pri-miRNA)在細(xì)胞核中被RNaseⅢ Drosha切割成為前體miRNA(pre-miRNA)。在最初的剪切后,Pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白exPortin-5的作用下、由
7、核內(nèi)轉(zhuǎn)到胞質(zhì)中,然后由另一種RNaseⅢ Dicer進(jìn)一步切割產(chǎn)生成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與其他蛋白質(zhì)一起組成RISC(RNA-inducedsileneing complex)復(fù)合體,從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制。
microRNAs具有重要的組織特異功能,在基因表達(dá)中發(fā)揮著總體調(diào)控作用,其中miR-421在腫瘤進(jìn)展調(diào)控,細(xì)胞增殖等方面起著重要的作用,目前對(duì)于鼻咽癌的調(diào)控作用尚缺少文獻(xiàn)報(bào)道。本課題將
8、探討miR-421在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用。本研究的目的是模擬天然miRNA構(gòu)建表達(dá)miRNA前體的質(zhì)粒,實(shí)現(xiàn)調(diào)控腫瘤相關(guān)基因miR-421的表達(dá),開(kāi)展對(duì)鼻咽癌的基因治療研究。
首先是調(diào)控目標(biāo)基因的miR-421表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和有效質(zhì)粒篩選。然后進(jìn)一步確定針對(duì)FOXO4基因的miRNA的有效作用位點(diǎn),觀察構(gòu)建的質(zhì)粒對(duì)鼻咽癌中兩個(gè)靶基因的調(diào)控效應(yīng),為后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。miRNA重組質(zhì)粒調(diào)控FOXO4表達(dá)能有效抑制腫瘤生
9、長(zhǎng),為進(jìn)一步的臨床研究打下了基礎(chǔ)。
第一部分
1、過(guò)表達(dá)miR-421促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖和抗凋亡的作用
目的:檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-421對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞增殖和抗凋亡的能力。
方法:利用慢病毒感染技術(shù),將miR-421轉(zhuǎn)染到CNE2,觀察體外miR-421對(duì)CNE2增殖作用,并利用Annexin V法及TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
結(jié)果:軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,miR-42
10、1過(guò)表達(dá)細(xì)胞的增殖速度是對(duì)照組的3倍,表明miR-421上調(diào)可以顯著增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外,Annexin V法及TUNEL檢測(cè)表明,miR-421的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞對(duì)于化療藥物順鉑的凋亡抵抗能力。這些結(jié)果表明,體外實(shí)驗(yàn)中,miR-421在鼻咽癌中扮演著調(diào)控細(xì)胞基因的作用。
結(jié)論:miR-421上調(diào)可促進(jìn)人鼻咽癌細(xì)胞的增殖,提高細(xì)胞凋亡抵抗能力。
2、抑制miR-421減少鼻咽癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋
11、亡的作用
目的:檢測(cè)抑制miR-421對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
方法:利用慢病毒感染技術(shù),將抑制miR-421轉(zhuǎn)染CNE2,觀察體外miR-421對(duì)CNE2增殖作用,并利用Annexin V法及TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
結(jié)果:軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,抑制miR-421后細(xì)胞的增殖速度降低,對(duì)照組是抑制組的3倍,表明抑制miR-421可以顯著降低鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外,Annexin
12、V法及TUNEL檢測(cè)表明,抑制miR-421可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞對(duì)于化療藥物順鉑的凋亡促進(jìn)能力。這些結(jié)果表明,體外實(shí)驗(yàn)中,miR-421在鼻咽癌中扮演著調(diào)控細(xì)胞基因的作用。
結(jié)論:抑制miR-421可降低人鼻咽癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
第二部分
1、探討miR-421對(duì)FOXO4信號(hào)途徑的作用
目的:研究miR-421促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖及抗凋亡的內(nèi)在分子機(jī)制是否通過(guò)FOXO4信號(hào)途
13、徑調(diào)節(jié)。
方法:構(gòu)建針對(duì)耙基因FOXO4的熒光素酶報(bào)告基因載體,利用熒光照度計(jì)分別測(cè)定正常組、miR-421過(guò)表達(dá)組與miR-421抑制組的熒光值。并利用實(shí)時(shí)定量PCR及western blot檢測(cè)FOXO4靶基因p21,p27,Bim和FasL的mRNA及蛋白表達(dá)情況。
結(jié)果:
1.在熒光素酶活性檢測(cè)中,F(xiàn)OXO4的熒光素酶活性在miR-421過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中降低,而在miR-421抑制的細(xì)胞中
14、表達(dá)增多。2.與此相一致的是,在正常組、miR-421過(guò)表達(dá)組與miR-421抑制組中發(fā)現(xiàn),F(xiàn)OXO4四個(gè)經(jīng)典靶點(diǎn)基因p21,p27,Bim和FasL的mRNA及蛋白表達(dá)在miR-421過(guò)表達(dá)組是下調(diào),而在miR-421抑制的細(xì)胞中,上述基因及蛋白上調(diào)。
結(jié)論:通過(guò)構(gòu)建熒光素酶以及過(guò)表達(dá)和抑制miR-421實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-421可抑制FOXO4信號(hào)通路。
2、miR-421與FOXO4調(diào)控關(guān)系探討
15、> 目的:探尋miR-421在基因調(diào)控中針對(duì)耙基因FOXO4調(diào)節(jié)作用。
方法:使用TargetScan軟件工具mir-421目標(biāo)預(yù)測(cè)分析表明,F(xiàn)OXO4是mir-421潛在目標(biāo),利用免疫印跡分析表明,在正常組、miR-421過(guò)表達(dá)組與miR-421抑制組中基因FOXO4的表達(dá)存在顯著的差異性,過(guò)表達(dá)組蛋白表達(dá)低于正常組,而抑制組蛋白表達(dá)高于正常組。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-421與FOXO4相互控制存在的
16、關(guān)系,克隆了FOXO43'UTR片段,含有miR-421結(jié)合位點(diǎn)的psiCHECK-2熒光素酶載體,同時(shí)我們克隆了FOXO43'UTR突變載體,具體突變了二個(gè)堿基。
通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)表明,miR-421過(guò)表達(dá)組低于正常組,而miR-421抑制組高于正常組。
另外,為了進(jìn)一步分析miR-421與FOXO4在凋亡中的相互作用,在抑制miR-421的時(shí),同時(shí)抑制FOXO4作對(duì)照,實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,抑制FOXO4基因后,
17、細(xì)胞凋亡低于單純抑制miR-421組。
結(jié)果:
1、miR-421過(guò)表達(dá)與miR-421抑制組中,基因FOXO4表達(dá)存在差異性;2、熒光素酶檢測(cè)表明,miR-421過(guò)表達(dá)與miR-421抑制組中熒光值存在差異性,而在突變體卻無(wú)此差異性;3、同時(shí)抑制miR-421時(shí),選擇下調(diào)基因FOXO4,結(jié)果表明,凋亡細(xì)胞低于單純抑制miR-421組。
結(jié)論:基因FOXO4是miR-421調(diào)控目的基因。
18、 3、FOXO4是細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凋亡的關(guān)鍵基因目的:探尋FOXO4在細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凋亡的調(diào)節(jié)作用。
方法:為了進(jìn)一步分析miR-421與FOXO4在凋亡中的作用,我們選擇將miR-421抑制時(shí),然后再單純抑制基因FOXO4來(lái)對(duì)照,檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示,在同時(shí)抑制miR-421時(shí),單純抑制FOXO4后細(xì)胞凋亡數(shù)減少。
結(jié)果:同時(shí)抑制miR-421時(shí),選擇下調(diào)基因FOXO4,結(jié)果表明,凋亡細(xì)胞低于單純抑制miR-421
19、組。
結(jié)論:FOXO4是細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凋亡的關(guān)鍵基因。
4、在鼻咽癌組織中miR-421與FOXO4的臨床相關(guān)性
目的:研究臨床鼻咽癌患者的腫瘤標(biāo)本中miR-421與FOXO4的關(guān)系。
方法:7例新鮮收集的人鼻咽癌樣本組織,利用QPCR技術(shù)檢測(cè)miR-421與FOXO4的表達(dá)量,同時(shí)采用免疫印跡法檢測(cè)FOXO4表達(dá)水平,并研究?jī)烧咧g的關(guān)系。
結(jié)果:在7例新鮮收集的鼻咽
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