miR-1182下調(diào)hTERT的分子機(jī)制及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、研究背景和目的:
　　人端粒酶(telomerase)是一種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的核糖核蛋白酶,主要由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、RNA亞單位(telomerase RNA component,hTR)以及端粒酶相關(guān)蛋白(telomerase associated protein1,TP1)組成,其主要作用是以自身RNA為模板,合成端粒重復(fù)序列,加至新合成

2、的DNA末端,以保護(hù)染色體端粒的長度,防止染色體的破壞。正常體細(xì)胞中,端粒酶是不表達(dá)的,因此,隨著細(xì)胞有絲分裂次數(shù)的增加,端粒長度逐漸縮短,細(xì)胞最終衰老死亡。而在85％的腫瘤細(xì)胞中端粒酶活化,活化的端粒酶合成端粒重復(fù)序列,因此可以保持腫瘤細(xì)胞端粒長度的動(dòng)態(tài)平衡,腫瘤細(xì)胞得以無限增殖。hTERT是端粒酶最重要的催化亞基,大多數(shù)腫瘤通過上調(diào)hTERT的表達(dá)來活化端粒酶,hTERT的表達(dá)可以作為端粒酶活化的一種標(biāo)志。此外,端粒酶及其hTERT

3、亞單位不僅參與了腫瘤的無限增殖過程,也參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移等過程。因此,hTERT已成為一個(gè)重要的腫瘤治療靶點(diǎn),深入研宄hTERT的調(diào)控機(jī)制對(duì)腫瘤的發(fā)生及其防治具有重要意義。
　　以前關(guān)于hTERT的調(diào)控研宄大多集中在轉(zhuǎn)錄水平,而轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控研宄則較少。microRNAs(miRNAs)是一類自然界廣泛存在的非編碼小RNA,主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。本課題組前期運(yùn)用miRNA芯片、生物信息學(xué)以及qRT-PCR等技術(shù)

4、,在胃癌中篩選出了9條可能調(diào)控hTERT的miRNA。在胃癌細(xì)胞過表達(dá)這9條miRNA, western blot發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-1266、miR-1207-5p和miR-1182后可明顯抑制 hTERT蛋白水平。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)僅miR-1266和miR-1207-5p能有效靶向hTERT的3’非翻譯區(qū)(3’UTR),而miR-1182在此區(qū)域無結(jié)合能力。那么miR-1182是否可以通過與3’UTR以外的其它區(qū)域結(jié)合從而調(diào)控hTER

5、T呢?近年來,大量研宄證據(jù)表明,除了3’ UTR,miRNA亦能結(jié)合于靶基因的開放讀碼框(ORF區(qū))以及5’非翻譯區(qū)(5’UTR),其中ORF區(qū)的miRNA靶點(diǎn)數(shù)量接近于3’UTR。基于以上分析,本研宄旨在明確miR-1182能否通過hTERTORF發(fā)揮其調(diào)控作用,并進(jìn)一步在動(dòng)物及臨床二個(gè)層面探討miR-1182與胃癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:miR-1182靶向調(diào)控hTERTORF區(qū)的實(shí)驗(yàn)研

6、究
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各胃癌細(xì)胞系中miR-1182的相對(duì)表達(dá)情況,;
　　2.Western blot檢測各胃癌胞系過表達(dá)miR-1182后,細(xì)胞hTERT的表達(dá)變化;
　　3.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR-1182對(duì)hTERTORF熒光素酶活性的影響;
　　4.生物信息學(xué)預(yù)測miR-1182在hTERTORF區(qū)的具體結(jié)合位點(diǎn),并比對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的物種間保守性;
　　5.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

7、以及點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)檢測miR-1182對(duì)hTERT ORF1、ORF2以及ORF1-MT熒光素酶活性的影響;
　　6.采用hTERTcDNA表達(dá)質(zhì)粒和miR-1182mimics共轉(zhuǎn)染內(nèi)源性hTERT低表達(dá)的U2OS細(xì)胞,Western blot檢測miR-1182對(duì)hTERT表達(dá)的影響;
　　第二部分:miR-1182抑制胃癌增殖及轉(zhuǎn)移的研究
　　1.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR在40例胃癌標(biāo)本中檢測miR-1182在癌和癌旁

8、的相對(duì)表達(dá);
　　2.根據(jù)40例胃癌標(biāo)本中miR-1182和hTERT的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)兩者的相關(guān)性;
　　3.通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測miR-1182對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響;
　　4.運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測miR-1182對(duì)胃癌細(xì)胞迀移能力的影響;
　　5.運(yùn)用小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)證明miR-1182對(duì)胃癌細(xì)胞體內(nèi)增殖能力的影響;
　　6.采用小鼠肺強(qiáng)制轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-1182對(duì)胃癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的

9、影響;
　　結(jié)果:
　　第一部分:miR-1182靶向調(diào)控hTERTORF區(qū)的實(shí)驗(yàn)研究
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)篩選出miR-1182相對(duì)表達(dá)含量較低的胃癌細(xì)胞系,即MKN28、HGC-27和SGC-7901細(xì)胞。
　　2.MKN28、HGC-27以及SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1182mimics后,Western Blot結(jié)果證實(shí)hTERT蛋白水平下調(diào)。
　　3.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明mi

10、R-1182能夠抑制含有hTERTORF的報(bào)告基因活性。
　　4.運(yùn)用miRandav3.3a軟件,將hTERT的ORF全長納入miR-1182的靶基因預(yù)測分析,發(fā)現(xiàn)在hTERT ORF區(qū),評(píng)分大于140分的miR-1182靶點(diǎn)有兩個(gè):ORF1、ORF2。進(jìn)一步在物種間比對(duì)這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)不同物種間這兩個(gè)區(qū)域均是高度保守的。
　　5.針對(duì)ORF1、ORF2的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明,miR-1182僅在ORF1有結(jié)合能

11、力,而不能與ORF2有效結(jié)合。雙熒光素酶突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明,突變ORF1與miR-1182的結(jié)合位點(diǎn)后,miR-1182不能抑制ORF1的報(bào)告基因活性。
　　6.在內(nèi)源性hTERT表達(dá)極低的U2OS細(xì)胞中,同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-1182 mimics和包含hTERT cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒,Western blot結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-1182mimics后細(xì)胞的hTERT表達(dá)明顯降低。將hTERT真核表達(dá)質(zhì)粒上miR-1

12、182的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行無義突變后,與miR-1182mimics再次共轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞,Western blot表明miR-1182失去對(duì)hTERT表達(dá)的抑制能力。
　　第二部分:miR-1182抑制胃癌增殖及轉(zhuǎn)移的研究
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,miR-1182在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。
　　2.40例胃癌標(biāo)本的相關(guān)性分析表明miR-1182與hTERT之間存在負(fù)相關(guān)。
　　3.CCK-8實(shí)驗(yàn)

13、證實(shí),過表達(dá)m iR-1182可明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力。
　　4.Transwell實(shí)驗(yàn)表明,過表達(dá)miR-1182mimics后可明顯抑制胃癌細(xì)胞迀移能力。
　　5.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)表明,miR-1182可抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)增殖能力以及腫瘤生長能力。
　　6.小鼠肺強(qiáng)制轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-1182對(duì)胃癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。
　　研究結(jié)論:
　　1.臨床研宄表明,miR-1182在胃癌中的表達(dá)顯著

14、低于與癌旁組織,且其表達(dá)與hTERT的表達(dá)存在負(fù)相關(guān);
　　2.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-1182可以明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖及迀移能力,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-1182可以明顯抑制胃癌細(xì)胞的成瘤及轉(zhuǎn)移能力,其機(jī)制是通過抑制胃癌細(xì)胞hTERT的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的;
　　3.miR-1182抑制胃癌細(xì)胞hTERT的表達(dá)是通過靶向hTERT的ORF1區(qū)實(shí)現(xiàn)的。
　　綜上所述,miR-1182通過靶向胃癌細(xì)胞hTERT ORF1位點(diǎn),負(fù)性調(diào)控h