CCL22及其受體CCR4在肝細(xì)胞癌局部免疫逃逸中的作用.pdf

1、目的:
　　肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范圍內(nèi)第五大常見的惡性腫瘤，是腫瘤相關(guān)性死亡的第三大病因。病因復(fù)雜，其中感染或自身免疫性疾病等因素導(dǎo)致的慢性炎癥持續(xù)存在，在腫瘤的產(chǎn)生、發(fā)展和預(yù)后中發(fā)揮重要作用,并影響機(jī)體的免疫監(jiān)控和對治療的應(yīng)答；人體的大多數(shù)腫瘤都依賴免疫細(xì)胞并可以通過免疫細(xì)胞獲益,從而調(diào)整免疫細(xì)胞使之處于免疫耐受或免疫缺陷狀態(tài)，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)控，從而導(dǎo)致疾

2、病進(jìn)展。因而，探討HCC免疫逃逸的發(fā)生機(jī)制將會為腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及治療提供重要的理論基礎(chǔ)和治療新思路。
　　在HCC腫瘤微環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)多種免疫抑制通路被激活，其中免疫細(xì)胞及相關(guān)的細(xì)胞因子起到了關(guān)鍵作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory Tcells，Treg)是一類具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細(xì)胞亞群，既往研究顯示Treg細(xì)胞在多種惡性腫瘤癌組織中比例增加，并且在HCC患者瘤內(nèi)的高表達(dá)常與疾病的進(jìn)展及預(yù)后不佳有關(guān)。但目前在腫瘤微

3、環(huán)境中Treg為什么以及如何被趨化，其機(jī)制目前仍不完全清楚，需要進(jìn)一步探究。HCC腫瘤微環(huán)境表達(dá)多種細(xì)胞因子，其中趨化因子CC家族中的CCL22及表達(dá)在Treg細(xì)胞上的高親和力受體CCR4在Treg的遷移運(yùn)動中起到重要作用，我們設(shè)想在HCC微環(huán)境內(nèi)通過CCL22與其受體CCR4的結(jié)合趨化Treg細(xì)胞的遷移運(yùn)動，從而引起腫瘤在肝癌局部免疫逃逸導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過檢測肝癌組織、癌旁組織標(biāo)本中CCL22的表達(dá)，以及CCL22的高親和力受

4、體CCR4在腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）、外周血單個核細(xì)胞（perpheral blood mononuclear cell，PBMC）中Treg細(xì)胞表面CCR4受體的表達(dá)，研究CCL22／CCR4信號通路招募Treg細(xì)胞并在腫瘤部位發(fā)生免疫逃逸的作用機(jī)制。
　　方法:
　　首先使用生物信息學(xué)，在CBioportal數(shù)據(jù)庫下載HCC患者癌組織內(nèi)目標(biāo)基因CCL22/

5、CCR4/CD4芯片信息，分析之間相關(guān)性，以及趨化因子及其受體的表達(dá)在數(shù)據(jù)庫中的信息。收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝癌患者腫瘤組織，癌旁組織及外周血，所入組患者肝組織經(jīng)病理學(xué)資料證實(shí)均為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。提取肝癌及癌旁組織內(nèi)的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用real-time PCR技術(shù)檢測趨化因子配體CCL22在肝癌組織和癌旁組織的表達(dá)，以及CD4+T細(xì)胞表面標(biāo)志胞內(nèi)因子Foxp3及功能因子IL-10在基因水平的表達(dá)。應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測HC

6、C患者癌組織CCL22表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系。應(yīng)用密度梯度方法，提取外周血PBMC和腫瘤TIL細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對T細(xì)胞亞群及趨化因子相應(yīng)高親和力受體進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:
　　1.分析數(shù)據(jù)庫芯片信息提示HCC患者癌組織內(nèi)CCR4基因與CCL22及CD4存在相關(guān)性（r=0.2 p<0.0001,r=0.2 p<0.0001）。
　　2.RT-PCR結(jié)果顯示趨化因子CCL22在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織（0.56±

7、0.06 vs0.31±0.04），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.免疫組化檢測趨化因子CCL22在HCC TNM分期I-III的表達(dá)，結(jié)果顯示CCL22在TNM II表達(dá)較TNM I高(4.231±0.2571 VS3.326±0.3671，P=0.04)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；TNM III表達(dá)較TNM I高(5.100±0.4033 VS3.326±0.3671，p=0.0048)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；TNM III較TNM II無差

8、異(5.100±0.4033 VS4.231±0.2571 p=0.0769)。通過Log-rank檢驗(yàn)分析高表達(dá)CCL22的患者和低表達(dá)CCL22的患者相比中位生存期分別為44個月，53個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.01)。CCL22表達(dá)高低在年齡，性別，HBeAg，ALT，AST，AFP中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，而在腫瘤TNM分期(p=0.005)，腫瘤大小(p=0.002)，腫瘤數(shù)目（p=0.038）,癌細(xì)胞分化(p

9、=0.031)中存在統(tǒng)計學(xué)差異。因此CCL22可能成為預(yù)測HCC進(jìn)展，預(yù)后的潛在預(yù)測指標(biāo)。
　　4.相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HCC患者的癌組織中，CCL22與Foxp3、CD4、IL10的表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的正相關(guān)（r=0.22，p<0.0001；r=0.24，p<0.0001；r=0.36，p<0.0001）。
　　5.流式結(jié)果顯示，總CD4+T細(xì)胞在 TIL中的比例較PBMC中升高(35.52±2.064 VS29.41±1

10、.96, p=0.03),Treg細(xì)胞亞群TIL中的比例16.60±1.29較PBMC中升高9.58±1.18，p=0.0001，CCR4+Treg細(xì)胞TIL中的比例亦較PBMC中升高(40.82±2.251 vs33.85±2.291, p=0.03),差異有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1.肝癌患者肝臟組織內(nèi)高表達(dá)CCL22，通過CCL22與受體CCR4結(jié)合，招募CD4+Foxp3+T(Treg)細(xì)胞向腫瘤部位聚集，引起