CCL22及其受體CCR4在肝細胞癌局部免疫逃逸中的作用.pdf

1、目的:
　　肝細胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范圍內第五大常見的惡性腫瘤，是腫瘤相關性死亡的第三大病因。病因復雜，其中感染或自身免疫性疾病等因素導致的慢性炎癥持續(xù)存在，在腫瘤的產生、發(fā)展和預后中發(fā)揮重要作用,并影響機體的免疫監(jiān)控和對治療的應答；人體的大多數腫瘤都依賴免疫細胞并可以通過免疫細胞獲益,從而調整免疫細胞使之處于免疫耐受或免疫缺陷狀態(tài)，使得腫瘤細胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)控，從而導致疾

2、病進展。因而，探討HCC免疫逃逸的發(fā)生機制將會為腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及治療提供重要的理論基礎和治療新思路。
　　在HCC腫瘤微環(huán)境中，發(fā)現多種免疫抑制通路被激活，其中免疫細胞及相關的細胞因子起到了關鍵作用。調節(jié)性T細胞(regulatory Tcells，Treg)是一類具有獨特免疫調節(jié)功能的T淋巴細胞亞群，既往研究顯示Treg細胞在多種惡性腫瘤癌組織中比例增加，并且在HCC患者瘤內的高表達常與疾病的進展及預后不佳有關。但目前在腫瘤微

3、環(huán)境中Treg為什么以及如何被趨化，其機制目前仍不完全清楚，需要進一步探究。HCC腫瘤微環(huán)境表達多種細胞因子，其中趨化因子CC家族中的CCL22及表達在Treg細胞上的高親和力受體CCR4在Treg的遷移運動中起到重要作用，我們設想在HCC微環(huán)境內通過CCL22與其受體CCR4的結合趨化Treg細胞的遷移運動，從而引起腫瘤在肝癌局部免疫逃逸導致腫瘤的發(fā)生。本實驗通過檢測肝癌組織、癌旁組織標本中CCL22的表達，以及CCL22的高親和力受

4、體CCR4在腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）、外周血單個核細胞（perpheral blood mononuclear cell，PBMC）中Treg細胞表面CCR4受體的表達，研究CCL22／CCR4信號通路招募Treg細胞并在腫瘤部位發(fā)生免疫逃逸的作用機制。
　　方法:
　　首先使用生物信息學，在CBioportal數據庫下載HCC患者癌組織內目標基因CCL22/

5、CCR4/CD4芯片信息，分析之間相關性，以及趨化因子及其受體的表達在數據庫中的信息。收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院肝癌患者腫瘤組織，癌旁組織及外周血，所入組患者肝組織經病理學資料證實均為原發(fā)性肝細胞癌。提取肝癌及癌旁組織內的RNA，反轉錄為cDNA，采用real-time PCR技術檢測趨化因子配體CCL22在肝癌組織和癌旁組織的表達，以及CD4+T細胞表面標志胞內因子Foxp3及功能因子IL-10在基因水平的表達。應用免疫組化技術檢測HC

6、C患者癌組織CCL22表達與臨床參數的關系。應用密度梯度方法，提取外周血PBMC和腫瘤TIL細胞，應用流式細胞儀對T細胞亞群及趨化因子相應高親和力受體進行檢測。
　　結果:
　　1.分析數據庫芯片信息提示HCC患者癌組織內CCR4基因與CCL22及CD4存在相關性（r=0.2 p<0.0001,r=0.2 p<0.0001）。
　　2.RT-PCR結果顯示趨化因子CCL22在肝細胞癌組織中的表達高于癌旁組織（0.56±

7、0.06 vs0.31±0.04），差異有統計學意義。
　　3.免疫組化檢測趨化因子CCL22在HCC TNM分期I-III的表達，結果顯示CCL22在TNM II表達較TNM I高(4.231±0.2571 VS3.326±0.3671，P=0.04)，差異有統計學意義；TNM III表達較TNM I高(5.100±0.4033 VS3.326±0.3671，p=0.0048)，差異有統計學意義；TNM III較TNM II無差

8、異(5.100±0.4033 VS4.231±0.2571 p=0.0769)。通過Log-rank檢驗分析高表達CCL22的患者和低表達CCL22的患者相比中位生存期分別為44個月，53個月，差異具有統計學意義(p=0.01)。CCL22表達高低在年齡，性別，HBeAg，ALT，AST，AFP中差異無統計學意義(p>0.05)，而在腫瘤TNM分期(p=0.005)，腫瘤大小(p=0.002)，腫瘤數目（p=0.038）,癌細胞分化(p

9、=0.031)中存在統計學差異。因此CCL22可能成為預測HCC進展，預后的潛在預測指標。
　　4.相關性分析結果顯示，HCC患者的癌組織中，CCL22與Foxp3、CD4、IL10的表達均呈現不同程度的正相關（r=0.22，p<0.0001；r=0.24，p<0.0001；r=0.36，p<0.0001）。
　　5.流式結果顯示，總CD4+T細胞在 TIL中的比例較PBMC中升高(35.52±2.064 VS29.41±1

10、.96, p=0.03),Treg細胞亞群TIL中的比例16.60±1.29較PBMC中升高9.58±1.18，p=0.0001，CCR4+Treg細胞TIL中的比例亦較PBMC中升高(40.82±2.251 vs33.85±2.291, p=0.03),差異有統計學差異。
　　結論:
　　1.肝癌患者肝臟組織內高表達CCL22，通過CCL22與受體CCR4結合，招募CD4+Foxp3+T(Treg)細胞向腫瘤部位聚集，引起