miR-22在內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的:
　　內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，廣泛存在于臍帶血、外周血及骨髓中，參與缺血性疾病血管新生和損傷后的血管內(nèi)皮的愈合修復(fù)。當(dāng)血管受到損傷后，EPCs從骨髓中釋放進(jìn)入外周血中，遷移至損傷部位，然后增殖分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)損傷血管再內(nèi)皮化。已有的大量研究表明，隨著年齡的增長，EPCs數(shù)量減少，其粘附、增殖、遷移和血管形成等功能也隨之衰退。這一結(jié)

2、論表明年齡的增長使EPCs呈現(xiàn)細(xì)胞衰老表型，但其確切的作用機(jī)制仍不清楚。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約為22個核苷酸左右的單鏈內(nèi)源性非編碼小RNA，廣泛存在于動物及植物中。miRNAs能夠通過與其靶基因的3'端非編碼區(qū)（3' untranslated region，UTR）進(jìn)行完全或不完全互補(bǔ)配對的方式直接降解其靶基因或者對其靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而參與細(xì)胞存活、衰老、增殖、分化、遷移等重要的細(xì)胞生理過程。

3、miRNAs的異常表達(dá)與多種疾病如心血管疾病等密切有關(guān)，而心血管疾病與EPCs又有著密切的關(guān)系。近年來，EPCs的衰老與miRNAs的關(guān)系受到人們的重點關(guān)注，如Zhao及其同事報道m(xù)iR-34a通過抑制沉默信息調(diào)控子1(Sirt1)的表達(dá)，加速EPCs的衰老，并降低細(xì)胞血管形成能力。Zhu課題組研究發(fā)現(xiàn)miR-10a和miR-21通過靶向Hmga2來調(diào)節(jié)小鼠EPCs的衰老、遷移、增殖、自我更新和體內(nèi)外血管形成能力;該研究的芯片結(jié)果也顯示

4、miR-22在小鼠老年組中表達(dá)量要高于小鼠年輕組。那么，miR-22在人老年組中是否也是高表達(dá)？miR-22是否在EPCs衰老過程中發(fā)揮生物學(xué)作用呢？為了解決這些問題，我們首先設(shè)置了年輕組（21歲左右）和老年組（66歲左右）兩組樣本，分離出EPCs，然后采用多種研究方法來研究miR-22對EPCs的細(xì)胞衰老、增殖、遷移和血管形成的影響。通過預(yù)測軟件的預(yù)測和生物信息學(xué)分析，推測Akt3可能是miR-22的潛在靶基因，最后采用各種實驗方法探

5、討Akt3與miR-22之間的關(guān)系，從而來闡明miR-22對EPCs衰老的作用機(jī)制。
　　方法:
　　(1)本研究設(shè)置兩組樣本，一組是年輕組（21歲左右），一組是（66歲左右），每組各3個樣本，采取其外周血，然后采用密度梯度離心法（淋巴分離液Ficoll）來分離外周血，獲得單個核細(xì)胞，最后運用貼壁分離法獲得較純的EPCs。
　　(2)采用DiI-AC-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光法和表面抗原CD133、CD31和

6、CD34檢測，對分離的EPCs進(jìn)行鑒定。采用熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗方法檢測miR-22在年輕組和老年組中的表達(dá)量。
　　(3)采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建慢病毒載體pLVTHM-miR-22和pLVTHM-anti-miR-22，然后與病毒包裝質(zhì)粒共同感染293T細(xì)胞，收集上清，檢測病毒滴度。
　　(4)慢病毒Lv-miR-22和Lv-anti-miR-22分別g感染青年組和老年組EPCs，采用qRT-PCR實驗方法

7、檢測轉(zhuǎn)染慢病毒的青年組和老年組EPCs中miR-22的表達(dá)量，采用β-半乳糖苷酶檢測、MTT增殖法、transwell細(xì)胞遷移法、體外血管形成檢測來檢測和觀察轉(zhuǎn)染后青年組和老年組EPCs的衰老、增殖、遷移和血管形成等生物行為的變化。
　　(5)利用TargetScan，miRanda和PicTar靶基因預(yù)測軟件，預(yù)測出Akt3可能是miR-22的一個潛在的靶基因。利用雙熒光素酶報告基因試驗驗證miR-22對Akt3的負(fù)向調(diào)控作用。

8、MiR-22在年輕組EPCs中過表達(dá)或老年組EPCs中抑制表達(dá)后利用qRT-PCR和免疫印跡實驗檢測Akt3 mRNA和蛋白水平的變化。
　　(6)構(gòu)建Akt3和Akt3-3'UTR慢病毒載體，感染年輕組EPCs-miR-22穩(wěn)轉(zhuǎn)株后，檢測其衰老、增殖、遷移和血管形成等生物行為的變化。
　　結(jié)果:
　　(1)剛分離的單個核細(xì)胞形狀呈圓形，且體積很小，1天后可見貼壁細(xì)胞形狀呈較粗的圓形、橢圓形或不規(guī)則形。培養(yǎng)7天后，長梭

9、形的內(nèi)皮樣細(xì)胞數(shù)增多且體積也增大，部分視野中可見由數(shù)個細(xì)胞形成的細(xì)胞集落。
　　(2)在激光共聚焦顯微鏡下觀察到分離得到的單個核細(xì)胞分化到第7天出現(xiàn)橙黃色雙染陽性細(xì)胞，表明細(xì)胞攝取了DiI-AC-LDL和FITC-UEA-I并證實了橙黃色雙染陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs。
　　(3)流式細(xì)胞儀檢測表面抗原CD133、CD31、CD34和VEGFR-2，陽性率分別為33.3％、51.7％、45.4％和47.2％。
　　(

10、4)老年組miR-22的表達(dá)量明顯高于年輕組。
　　(5)年輕組和老年組EPCs分別感染miR-22和anti-miR-22慢病毒后，與對照組相比，感染miR-22的年輕組中miR-22表達(dá)量顯著上調(diào)，衰老細(xì)胞數(shù)明顯增加，細(xì)胞增殖、遷移和血管形成能力明顯下降;另一方面，感染anti-miR-22的老年組中miR-22表達(dá)量明顯下降，衰老細(xì)胞數(shù)也明顯下降，其增殖、遷移和血管形成等生物學(xué)功能卻上調(diào)。
　　(6)熒光素酶報告基因?qū)?/p>

11、驗證實，miR-22可以抑制野生型Akt3-3'UTR-WT的熒光報告基因的活性，而對突變型Akt3-3'UTR-MUT沒有影響。此外，miR-22過表達(dá)引起Y-EPCs中Akt3的基因和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)明顯低于對照組，而anti-miR-22導(dǎo)致A-EPCs中Akt3的表達(dá)水平明顯上調(diào)。
　　(7) Akt3過表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-22對Y-EPCs的增殖、遷移和血管形成的抑制作用和對細(xì)胞衰老的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論: