活化型高分子量激肽原誘導內皮祖細胞衰老及其分子機制的研究.pdf

1、[研究目的]
　　 高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HK)是血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system，KKS)的主要成分之一，當KKS活化時，HK被降解為活化型的高分子量激肽原(HKa)。眾多資料表明，KKS活化參與多種生理與病理學過程，因此認識活化產物HKa的血管生物學功能具有十分重要的意義。內皮祖細胞(EPC)是成熟內皮細胞(EC)的前身，在促進內

2、皮再生和新生血管中發(fā)揮重要作用。雖然有研究表明，HKa抑制EC功能，但是HKa是否調控EPC功能不清楚。在這項研究中，我們檢測了HKa是否誘導EPCs的衰老，并對其作用的分子機制進行了探索。
　　 [研究方法]
　　 (1)我們從人外周血分離EPC，并建立可體外培養(yǎng)的細胞株。(2)為判定HKa是否影響EPC的功能，50nMHKa處理EPCs，檢測其對EPC克隆形成及增殖能力的影響。(3)為檢測HKa是否加速EPCs衰老，

3、30-100nMHKa處理EPCs，檢測酸性β-半乳糖苷酶活性和端粒酶活性情況。(4)為研究HKa加速EPCs衰老的機制，我們分別使用10、30、50、100nMHKa處理EPCs，檢測胞內ROS產生、JNK在Thr183/Tyr185位點和轉錄因子FOXO4在Thr451位點的磷酸化及p38激酶的磷酸化、錳超氧化物歧化酶和p16的表達情況。(5)為確定HKa的功能域，我們構建了人源HK重鏈(HC，19-380aa)和輕鏈(LC，390

4、-644aa)重組蛋白，分析HKa作用的結構域。
　　 [研究結果]
　　 (1)HKa抑制EPCs克隆形成及增殖能力。(2)HKa處理后的EPC變得大且扁平并出現(xiàn)空泡。使用酸性β-半乳糖苷酶染色法檢測，顯示HKa導致衰老細胞的百分比增加了2-3倍(P＜0.01)，HKa抑制EPCs端粒酶的活性。(3)HKa增加胞內ROS的產生，增強JNK在Thr183/Tyr185位點、FOXO4在Thr451位點的磷酸化以及p38激

5、酶的磷酸化，上調MnSOD和衰老分子p16的mRNA水平及蛋白表達水平。p38激酶的抑制劑SB203580，不僅減弱HKa誘導的p16的表達，也抑制EPCs衰老。(4)與HKa作用相似，HK的重鏈增加衰老內皮祖細胞的百分比(63±6.6％forHKav.s.77.5±6.02％forHC)，并誘導JNK、FOXO4在相應位點的磷酸化，及MnSOD的表達。此外，HKa和HC均能刺激胞內H2O2的產生。
　　 [結論]