血漿高分子量激肽原在宿主防御細(xì)菌感染中的作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、【研究背景和意義】
　　血漿高分子量激肽原（High molecular weight kininogen，HK）是血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（Plasma kallikrein-kinin system，KKS）的關(guān)鍵蛋白。已有體外研究表明，HK的第三個結(jié)構(gòu)域和第五個結(jié)構(gòu)域的片段均具有抗菌作用。但是，對于HK在體內(nèi)的作用仍然是未知的。本研究使用HK蛋白缺陷的Kng1-/-小鼠，研究HK在宿主防御細(xì)菌感染中的作用并初步探究其作用機(jī)制

2、。
　　【研究目的】
　　認(rèn)識HK蛋白在宿主防御細(xì)菌感染中的作用并初步探究其作用機(jī)制。
　　【研究方法】
　　建立大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）腹腔注射模型和盲腸結(jié)扎穿孔（Cecal ligation and puncture，CLP）模型，觀察Kng1-/-小鼠和其同窩對照Kng1+/+小鼠的生存率，并繪制生存曲線。通過H&E染色觀察和評價盲腸結(jié)扎穿孔模型中肺臟和肝臟的病理變化；應(yīng)用

3、血平板計(jì)數(shù)檢測腹腔灌洗液、血液及脾臟和肝臟組織中細(xì)菌的數(shù)目；應(yīng)用實(shí)時定量 PCR檢測白細(xì)胞中炎癥因子 mRNA的表達(dá)水平；利用Western blotting方法檢測 HK與細(xì)菌的結(jié)合及 HK的裂解；利用 Kng1+/+小鼠和Kng1-/-小鼠血漿檢測HK蛋白的殺菌效率；利用PK抑制劑DX-2930和FXII抑制劑CTI對血漿蛋白活性的干預(yù)，檢測大腸桿菌導(dǎo)致HK的裂解及HK的殺菌效率是否依賴于KKS的活化。
　　【研究結(jié)果】

4、>　　（1）Kng1基因敲除小鼠肝臟中沒有Kng1 mRNA的表達(dá)，并且血漿中檢測不到HK蛋白，證實(shí)Kng1基因敲除小鼠模型建立成功。（2）在細(xì)菌感染模型中，與Kng1+/+小鼠相比，Kng1-/-小鼠的生存率明顯降低（大腸桿菌腹腔注射模型中小鼠的生存率：67.5％vs.11.111%，p=0.0017；盲腸結(jié)扎穿孔模型中小鼠的生存率：75%vs.11.667%，p=0.0434；Kng1+/+vs. Kng1-/-），提示血漿HK在宿

5、主防御細(xì)菌感染中具有保護(hù)作用；（3）H&E染色結(jié)果顯示，盲腸結(jié)扎穿孔模型中，Kng1+/+小鼠肺組織中有少量炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)增生較弱，肝臟有輕微氣球樣變性，提示細(xì)菌感染可以導(dǎo)致肺臟及肝臟病理損傷。而Kng1-/-小鼠上述肺臟和肝臟病理表現(xiàn)明顯加重，肺組織中可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)增生明顯，肝臟發(fā)生明顯氣球樣變性。上述觀察提示在細(xì)菌感染中，HK的缺陷可以加劇肺和肝臟組織損傷；（4）在大腸桿菌（108 colony-forming

6、unit（CFU），200l）腹腔注射后18小時，Kng1+/+小鼠腹腔灌洗液、血液、肝臟和脾臟中可以檢測到少量細(xì)菌的存在，提示細(xì)菌感染模型成功構(gòu)建。Kng1-/-小鼠上述組分中細(xì)菌的數(shù)目明顯增多（腹腔灌洗液：235000±59690 vs.944400±156400 CFU，p=0.0002；血液：0.5000±0.1581 vs.3.938±1.142 CFU，p=0.0056；肝臟：90630±32260 vs.845600±15

7、6200 CFU，p<0.0001；脾臟：338100±71100 vs.1033000±154700 CFU，p=0.0003；Kng1+/+ vs. Kng1-/-），提示在細(xì)菌感染中，HK的缺陷抑制體內(nèi)細(xì)菌的清除。（5）應(yīng)用實(shí)時定量 PCR發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，HK的缺陷對炎癥因子的表達(dá)無影響。在大腸桿菌（108 CFU，200?l）腹腔注射6小時后，與Kng1+/+小鼠相比，Kng1-/-小鼠白細(xì)胞中炎癥因子 TNF-α和 IL-

8、6的mRNA水平顯著升高（TNF-α：17.00±5.110 vs.83.20±9.640，p=0.0001；IL-6：70.61±38.39 vs.1374±348.4，p=0.0059；Kng1+/+vs. Kng1-/-）。以上結(jié)果提示，在細(xì)菌感染模型中，HK的缺陷可以上調(diào)白細(xì)胞中炎癥因子mRNA水平的表達(dá)；（6）大腸桿菌和小鼠血漿共孵育后，結(jié)合Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌可以與血漿中 HK結(jié)合并且使 HK發(fā)

9、生裂解。當(dāng) Kng1+/+和Kng1-/-小鼠血漿與細(xì)菌共孵育后，與 Kng1+/+血漿相比，Kng1-/-血漿中細(xì)菌的數(shù)目有明顯增加（共孵育1小時：21110±4231 vs.47000±8825 CFU，p=0.0207；共孵育2小時：4020±613.9 vs.6910±122.7 CFU，p=0.0494；Kng1+/+vs. Kng1-/-），進(jìn)一步運(yùn)用純品HK與細(xì)菌共孵育，HK不被裂解，且細(xì)菌的數(shù)目與陰性對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義，提示，只有裂解后的HK具有抗菌作用。（7）大腸桿菌分別與含有PK抑制劑（DX-2930）和FXII抑制劑（CTI）的人的血漿共孵育后，含有抑制劑的血漿中HK不裂解。與正常血漿相比，抑制血漿中PK和FXII活性后導(dǎo)致細(xì)菌的清除率降低（共孵育10小時：39600±5913 vs.68600±7305 CFU，p=0.0128；共孵育20小時：22400±3473 vs.36800±4236 CFU，p=0.0302；正常血漿 vs.含