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文檔簡介
1、目的:
由于缺乏預(yù)防性疫苗且治療費(fèi)用昂貴,慢性丙型病毒性肝炎仍然是世界范圍內(nèi)重大的公共衛(wèi)生難題。目前丙型肝炎病毒(hepatitis C,HCV)感染慢性化機(jī)制尚不明確,有研究表明CD8+T細(xì)胞應(yīng)答失敗可能為HCV感染慢性化的重要機(jī)制之一。在歐美人群中的研究發(fā)現(xiàn)HCV病毒序列在宿主免疫壓力下能夠發(fā)生選擇性逃逸突變,進(jìn)而影響病毒特異性CTL應(yīng)答。中國人群與歐美人群遺傳背景不同,HCV在不同遺傳背景人群中的逃逸突變可能不同。目前在
2、中國乃至亞洲地區(qū)人群中尚無宿主遺傳背景對于HCV逃逸CTL應(yīng)答的研究。由于中國HCV主要基因型為1b型,且研究發(fā)現(xiàn)HCVNS3區(qū)存在較多CD8+T細(xì)胞表位,因此本研究擬擴(kuò)增湖北地區(qū)人群HCV1b型NS3區(qū)序列,分析湖北地區(qū)HCV1b型序列變異情況,序列進(jìn)化以及演變的規(guī)律;對湖北地區(qū)慢性 HCV1b型患者進(jìn)行HLA-A以及B類分子基因分型檢測,分析湖北地區(qū)人群HLA-I類分子遺傳背景與中國其他地區(qū)人群的異同之處,并比較數(shù)據(jù)庫中中國人群以及
3、德國人群HLA-A以及B類分子等位基因頻率的異同;分析中國慢性HCV1b型NS3區(qū)在HLA-I類分子免疫壓力下發(fā)生選擇性逃逸突變的情況,比較不同遺傳背景人群中HCV1b型NS3區(qū)選擇性逃逸突變的差異;驗證HCV在HLA-I類分子限制性表位內(nèi)發(fā)生選擇性逃逸突變對于 CTL應(yīng)答的影響。旨在明確中國人群宿主免疫壓力下HCV1b型的選擇性逃逸突變情況,探尋中國人群中HCV1b型選擇性逃逸突變對HCV感染慢性化以及HCV特異性CTL應(yīng)答的影響及其
4、可能的機(jī)制。
方法
1.收集慢性HCV1b型感染患者全血,分離血清,抽提血清中HCV RNA,采用型別特異性引物擴(kuò)增法進(jìn)行HCV基因分型。對HCV1b基因型的HCV采用巢式PCR方法進(jìn)行NS3區(qū)擴(kuò)增并測序。使用生物信息學(xué)軟件將HCV1b型患者的HCV NS3區(qū)序列進(jìn)行序列比對,分析HCV NS3區(qū)的序列變異情況,并與其他地區(qū)HCV1b型NS3區(qū)以及德國anti-D人群NS3區(qū)序列進(jìn)行序列比對以及進(jìn)化樹分析。
5、 2.分離血細(xì)胞,進(jìn)行基因組DNA抽提,采用型別特異性引物PCR方法檢測湖北地區(qū)HCV1b型患者相應(yīng)的HLA-A及B類分子等位基因。分析本實驗中人群HLA-A及HLA-B類分子基因頻率,并比較德國人群與中國人群HLA-A及HLA-B類分子基因頻率。
3.使用生物信息學(xué)軟件分析中國人群HCV1b型NS3區(qū)HLA-I類分子限制性CD8+T細(xì)胞表位內(nèi)的序列突變是否與相應(yīng)的HLA-I類分子相關(guān)。比較中國人群的突變情況與德國人群突變情況
6、。
4.使用合成多肽對表達(dá)相應(yīng)的等位基因的慢性HCV患者的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行HCV特異性增殖以及再刺激后進(jìn)行IFN-γ細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色,再使用流式細(xì)胞術(shù)檢測分泌IFN-γ的細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的比值,進(jìn)一步驗證CD8+T細(xì)胞表位內(nèi)的選擇性突變對T細(xì)胞識別的影響。
結(jié)果
1.本實驗共獲得1b型HCV NS3區(qū)全長序列89例。所得序列經(jīng)進(jìn)一步進(jìn)化樹分析確認(rèn)為1b型,且湖北地區(qū)序列與中國其他地區(qū)1b型序列親緣性
7、近,與日本、東南亞地區(qū)及歐美地區(qū)的1b型親緣性遠(yuǎn);將本實驗擴(kuò)增獲得的中國HCV1b型NS3區(qū)與德國感染同一來源HCV污染的免疫球蛋白人群(anti-D cohort)NS3區(qū)以及德國散發(fā)感染人群的HCV1b型NS3區(qū)進(jìn)行進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)中國人群序列主要落于兩個進(jìn)化叢內(nèi),德國人群中anti-D cohort NS3區(qū)落于三個進(jìn)化叢內(nèi),其他散發(fā)感染的1b型序列未見明顯進(jìn)化叢。在本實驗中89例序列的兩個進(jìn)化之間,患者性別,年齡,病毒載量以及H
8、LA-I類分子表達(dá)頻率無明顯差異,提示中國HCV1b型兩個進(jìn)化叢的產(chǎn)生主要是可能由于不同的兩個原始感染源所致。
2. HLA-A及B類分子分型檢測結(jié)果顯示:本實驗中人群表達(dá)頻率較高的HLA-A類分子有HLA-A*11(25.77%)、HLA-A*02(28.83%)、HLA-A*24(16.56%)、HLA-A*30(4.91%)和HLA-A*33(9.82%),表達(dá)頻率較高的HLA-B類分子有HLA-B*40(13.25%)
9、、HLA-B*15(15.66%)、HLA-B*13(13.86%)、HLA-B*46(14.46%)以及HLA-B*58(9.64%)。湖北地區(qū)人群與數(shù)據(jù)庫中中國人群的HLA-A及B類分子基因頻率無明顯差異。將數(shù)據(jù)庫中德國人群HLA-A以及HLA-B類分子的表達(dá)頻率與中國人群平均值進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)德國人群與中國人群的HLA-I類分子表達(dá)頻率有明顯差異:在HLA-A類分子中,中國人群中表達(dá)頻率較高的HLA-A*11、HLA-A*24和HL
10、A-A*33在德國人群中表達(dá)頻率較低,而在德國人群中表達(dá)頻率高的HLA-A*03以及 HLA-A*01在中國人群中表達(dá)頻率較低。在HLA-B類分子中,中國人群中表達(dá)頻率較高的HLA-B*40、HLA-B*15、HLA-B*13、HLA-B*51、HLA-B*58和HLA-B*46在德國人群中表達(dá)頻率較低,而在德國人群中表達(dá)頻率高的HLA-B*44、HLA-B*07、HLA-B*08以及HLA-B*35在中國人群中表達(dá)頻率較低。
11、 3. HLA-A及HLA-B類分子限制性表位內(nèi)選擇性逃逸突變分析結(jié)果顯示中國人群慢性HCV1b型感染患者體內(nèi)存在HLA-A及B類分子免疫壓力下的選擇性逃逸突變。在九個CD8+T細(xì)胞表位內(nèi)相應(yīng)HLA-A及B類分子陽性患者的突變頻率顯著高于陰性患者,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。將本實驗中 HCV1b型序列在HLA-A以及B類分子的免疫壓力下發(fā)生的逃逸突變與德國人群中的逃逸突變進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)兩組人群HCV1b型在免疫壓力下的選擇性逃逸突變情況不同。
12、4.體外T細(xì)胞功能檢測實驗結(jié)果驗證了新的HLA-A*11表位NS31635-1644,證實了該表位內(nèi)HLA-A*11壓力下的V1635I選擇性逃逸突變能夠影響CTL應(yīng)答,NS31635-1644表位肽第二位的T1636N以及T1636S突變可影響CD8+T細(xì)胞應(yīng)答,而1636位其他突變類型則不影響CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。NS31635-16441b型原型所占比例在HLA-B*75陽性患者中顯著高于HLA-B*75陰性患者。
結(jié)論<
13、br> 本研究詳細(xì)探討了中國地區(qū)HCV1b型的NS3區(qū)序列變異情況,對中國地區(qū)HCV1b型序列的演變進(jìn)行了分析,系統(tǒng)比較了中國不同地區(qū)以及中國人群與德國人群HLA-A、B類分子基因頻率之間的差異,進(jìn)行了中國人群HCV1b型在宿主免疫壓力下逃逸突變的分析,以及體外 T細(xì)胞功能檢測實驗。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國與德國人群的 HLA-A、B類分子表達(dá)頻率存在明顯差異,同時進(jìn)一步驗證了中國HCV1b型可能存在兩個主要感染源;發(fā)現(xiàn)中國人群中存在宿主免疫
14、壓力下HCV1b型的逃逸突變,且中國及德國人群HCV1b型在免疫壓力下的選擇性逃逸突變不同,提示在不同遺傳背景人群中HCV1b型在宿主免疫壓力下的選擇性逃逸突變不同。我們還發(fā)現(xiàn)了HCV1b型新的HLA-A*11限制性表位,驗證了HLA-I類分子免疫壓力下HCV1b型病毒序列的逃逸突變能夠影響CD8+T細(xì)胞應(yīng)答,且表位肽不同位點的突變或相同位點不同的氨基酸突變對CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的影響各不相同,提示只有特定的氨基酸突變才能夠影響 CTL應(yīng)
15、答。NS31635-16441b型原型所占比例在HLA-B*75陽性患者中顯著高于HLA-B*75陰性患者。提示該位點突變在 HLA-B*75陽性患者中可能有恢復(fù)至原型的趨勢,推測HLA-B*75對HCV1b中國一致序列感染的患者可能有保護(hù)作用。
本研究于國內(nèi)外首次分析了中國乃至亞洲地區(qū)人群遺傳背景對于HCV1b型逃逸宿主免疫應(yīng)答的影響,部分闡述了中國人群HLA-I類分子參與HCV1b型免疫逃逸的機(jī)制,為后續(xù)基于T細(xì)胞應(yīng)答的H
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