P-smad3L在TGF-β誘導胃癌細胞表達fascin中的作用.pdf

1、背景與目的：
　　我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，其死因多為轉移，因此急需探討其轉移機制。TGF-β是一種有趣的蛋白分子，早期可抑制腫瘤生長，晚期卻促進腫瘤浸潤與轉移。本課題組前期研究表明外源性TGF-β能明顯促進胃癌細胞的浸潤和轉移，但其功能轉換的機制尚未明確。smad3是TGF-β信號通路中的重要分子，其磷酸化分為羧基末端的磷酸化(p-smad3C)和連接區(qū)的磷酸化(p-smad3L)，研究表明，TGF-β誘導的生長抑制作用由p-smad

2、3C介導，而TGF-β促浸潤與轉移作用可由p-smad3L介導。fascin是一種在正常上皮中極少表達的細胞骨架蛋白，在胃癌等多種腫瘤中高表達，與胃癌的浸潤和淋巴結轉移密切相關。本研究旨在探討p-smad3L信號級聯(lián)在TGF-β誘導胃癌細胞中表達fascin的作用，為進一步闡明TGF-β信號通路在胃癌惡性進展中的分子機制提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　(1)采用細胞免疫熒光檢測TGF-β處理前后細胞fascin的表達以及癌細

3、胞表面?zhèn)巫愕纳L;(2) RT-PCR和western blotting檢測TGF-β1處理前后以及處理不同的時間點后對fascin表達的影響;(3) RT-PCR和western blotting檢測 smad3 siRNA對TGF-β1誘導fascin表達的影響;(4)western blotting檢測TGF-β1處理不同的時間點后對smad3連接區(qū)s204、s208、s213磷酸化水平的影響;(5)構建fascin報告基因質(zhì)粒，

4、檢測TGF-β1及不同smad3突變體對fascin啟動子報告基因活性的影響。
　　結果：
　　(1)TGF-β1刺激胃癌細胞株MKN45和AGS后，細胞表面?zhèn)巫忝黠@增多;(2) TGF-β1刺激胃癌細胞株MKN45、BGC823以及AGS后，可見fascin在三株細胞中表達量均升高并且存在明顯的時間規(guī)律，表現(xiàn)為其mRNA的增強有一個0.5-2h的延遲，2-4h達到高峰，而蛋白的增強有一個0.5-2h的延遲，4-8h達到高峰

5、并維持4-12h后逐漸減弱;(3)瞬時轉染smad3 siRNA后，加入TGF-β1刺激細胞，可見smad3 siRNA有效的降低了smad3的表達，并顯著抑制了TGF-β1對fascin的誘導表達。(4)TGF-β1刺激人胃癌細胞株MKN45、BGC823以及AGS后，可見在三株細胞中smad3的連接區(qū)磷酸化位點s204、s208、s213的蛋白表達量均明顯升高，存在一定的時間規(guī)律并與fascin表達的時間規(guī)律一致，表現(xiàn)為一個0.5-

6、2h的延遲期，延遲期后穩(wěn)定升高，1-4h達到高峰并維持2-4h后逐漸減弱;(5)構建fascin報告基因質(zhì)粒pGL3-FSCN1-Luc(-1375～+81)，胃癌細胞MKN45和BGC823在TGF-β1處理后，smad3WT（野生型）、smad3 EPSM(smad3連接區(qū)突變體，連接區(qū)不能被磷酸化)和smad33A（smad3羧基末端突變體，羧基末端不能被磷酸化）各組間的fascin-Luc活性比TGF-β1處理前明顯增高（P＜0

7、.05);TGF-β1處理后，smad3 WT轉染組fascin-Luc的活性較單純TGF-β1處理組活性明顯增高（P＜0.05)。
　　結論：
　　(1)TGF-β1能夠促進胃癌細胞偽足的形成;(2) TGF-β1能夠誘導胃癌細胞fascin的表達，并且其表達具有時間規(guī)律性;smad3基因表達的下調(diào)能抑制TGF-β1對fascin的誘導作用;TGF-β1能夠通過smad3增加fascin的啟動子活性;(3)TGF-β1能夠