P-smad3L在TGF-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞表達(dá)fascin中的作用.pdf

1、背景與目的：
　　我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，其死因多為轉(zhuǎn)移，因此急需探討其轉(zhuǎn)移機(jī)制。TGF-β是一種有趣的蛋白分子，早期可抑制腫瘤生長，晚期卻促進(jìn)腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移。本課題組前期研究表明外源性TGF-β能明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，但其功能轉(zhuǎn)換的機(jī)制尚未明確。smad3是TGF-β信號(hào)通路中的重要分子，其磷酸化分為羧基末端的磷酸化(p-smad3C)和連接區(qū)的磷酸化(p-smad3L)，研究表明，TGF-β誘導(dǎo)的生長抑制作用由p-smad

2、3C介導(dǎo)，而TGF-β促浸潤與轉(zhuǎn)移作用可由p-smad3L介導(dǎo)。fascin是一種在正常上皮中極少表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白，在胃癌等多種腫瘤中高表達(dá)，與胃癌的浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究旨在探討p-smad3L信號(hào)級(jí)聯(lián)在TGF-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞中表達(dá)fascin的作用，為進(jìn)一步闡明TGF-β信號(hào)通路在胃癌惡性進(jìn)展中的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　(1)采用細(xì)胞免疫熒光檢測TGF-β處理前后細(xì)胞fascin的表達(dá)以及癌細(xì)

3、胞表面?zhèn)巫愕纳L;(2) RT-PCR和western blotting檢測TGF-β1處理前后以及處理不同的時(shí)間點(diǎn)后對(duì)fascin表達(dá)的影響;(3) RT-PCR和western blotting檢測 smad3 siRNA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)fascin表達(dá)的影響;(4)western blotting檢測TGF-β1處理不同的時(shí)間點(diǎn)后對(duì)smad3連接區(qū)s204、s208、s213磷酸化水平的影響;(5)構(gòu)建fascin報(bào)告基因質(zhì)粒，

4、檢測TGF-β1及不同smad3突變體對(duì)fascin啟動(dòng)子報(bào)告基因活性的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)TGF-β1刺激胃癌細(xì)胞株MKN45和AGS后，細(xì)胞表面?zhèn)巫忝黠@增多;(2) TGF-β1刺激胃癌細(xì)胞株MKN45、BGC823以及AGS后，可見fascin在三株細(xì)胞中表達(dá)量均升高并且存在明顯的時(shí)間規(guī)律，表現(xiàn)為其mRNA的增強(qiáng)有一個(gè)0.5-2h的延遲，2-4h達(dá)到高峰，而蛋白的增強(qiáng)有一個(gè)0.5-2h的延遲，4-8h達(dá)到高峰

5、并維持4-12h后逐漸減弱;(3)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染smad3 siRNA后，加入TGF-β1刺激細(xì)胞，可見smad3 siRNA有效的降低了smad3的表達(dá)，并顯著抑制了TGF-β1對(duì)fascin的誘導(dǎo)表達(dá)。(4)TGF-β1刺激人胃癌細(xì)胞株MKN45、BGC823以及AGS后，可見在三株細(xì)胞中smad3的連接區(qū)磷酸化位點(diǎn)s204、s208、s213的蛋白表達(dá)量均明顯升高，存在一定的時(shí)間規(guī)律并與fascin表達(dá)的時(shí)間規(guī)律一致，表現(xiàn)為一個(gè)0.5-

6、2h的延遲期，延遲期后穩(wěn)定升高，1-4h達(dá)到高峰并維持2-4h后逐漸減弱;(5)構(gòu)建fascin報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-FSCN1-Luc(-1375～+81)，胃癌細(xì)胞MKN45和BGC823在TGF-β1處理后，smad3WT（野生型）、smad3 EPSM(smad3連接區(qū)突變體，連接區(qū)不能被磷酸化)和smad33A（smad3羧基末端突變體，羧基末端不能被磷酸化）各組間的fascin-Luc活性比TGF-β1處理前明顯增高（P＜0

7、.05);TGF-β1處理后，smad3 WT轉(zhuǎn)染組fascin-Luc的活性較單純TGF-β1處理組活性明顯增高（P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)TGF-β1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞偽足的形成;(2) TGF-β1能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞fascin的表達(dá)，并且其表達(dá)具有時(shí)間規(guī)律性;smad3基因表達(dá)的下調(diào)能抑制TGF-β1對(duì)fascin的誘導(dǎo)作用;TGF-β1能夠通過smad3增加fascin的啟動(dòng)子活性;(3)TGF-β1能夠