褪黑素在自噬介導(dǎo)的小鼠肝癌H22細(xì)胞存活中的作用.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文褪黑素在自噬介導(dǎo)的小鼠肝癌H22細(xì)胞存活中的作用姓名：劉暢申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)（呼吸病學(xué)）指導(dǎo)教師：于忠和；鄭詠秋201205第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文測(cè)自噬標(biāo)志性蛋白Beclin1的表達(dá)和自噬標(biāo)志物L(fēng)C3I向LC3II的轉(zhuǎn)換及AM／mTOR信號(hào)通路的抑制；熒光染色免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)LC3分子表達(dá)。3、體外實(shí)驗(yàn)采用慢病毒載體Beclin1shRNA敲減IL22細(xì)胞Beclin1表達(dá)，以及自噬特異性阻斷劑

2、3甲基腺嘌呤(3methyladenine，3MA)阻斷H22細(xì)胞自噬通路。采用細(xì)胞活性測(cè)定法(MTT法)檢測(cè)自噬通路阻斷后褪黑素對(duì)細(xì)胞存活的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)自噬通路阻斷后褪黑素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：1、成功建立H22荷瘤小鼠模型。在褪黑素處理組中，小鼠腫瘤的重量明顯降低；褪黑素處理組腫瘤的體積也顯著降低，且具有一定的量效關(guān)系。在解剖時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組荷瘤小鼠的腫瘤包膜很不完整，基部比較寬，導(dǎo)致腫瘤組織不容易剝離，而褪黑素處理組小

3、鼠的腫瘤體積變小，包膜比較完整，很容易剝離，這充分說明褪黑素具有抗腫瘤功能，能夠限制腫瘤的生長，并且這種抑制作用具有劑量依賴性。2、經(jīng)褪黑素處理的I122荷瘤小鼠的腫瘤組織Beclin一1表達(dá)下降，LC3一Ⅱ／LC3I比值升高。本研究首次證明了褪黑素能夠在1422荷瘤小鼠模型體內(nèi)促進(jìn)自噬，增加自噬相關(guān)的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)自噬相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化。我們的研究還表明，褪黑素抑制Akt和mTOR的磷酸化。這證明，褪黑素可在H22荷瘤小鼠體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞自

4、噬過程可能與其對(duì)P13K／Akt／mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。3、通過對(duì)Ⅲ型P13K信號(hào)通路的抑制，3MA阻止了自噬反應(yīng)，并且在培養(yǎng)的1122細(xì)胞系中，減弱了褪黑素所抑制的H22細(xì)胞增殖功能，同時(shí)促進(jìn)了褪黑素誘導(dǎo)的H22細(xì)胞凋亡。通過敲減Beclin1的表達(dá)抑制自噬，減少了褪黑素抑制的H22細(xì)胞增殖功能，同時(shí)促進(jìn)了褪黑素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些數(shù)據(jù)表明，通過作用于III型P13K／Beclin1信號(hào)通路，褪黑素可以激活保護(hù)性自噬反應(yīng)以適應(yīng)嚴(yán)

5、峻的環(huán)境，并保護(hù)H22肝癌細(xì)胞免于死亡。對(duì)保護(hù)性自噬的抑制可以提高褪黑素抗腫瘤作用。另外，治療藥物結(jié)合自噬抑制劑可能具有抑制腫瘤發(fā)展的協(xié)同作用。這項(xiàng)研究闡明了細(xì)胞凋亡和褪黑素誘導(dǎo)的自噬之間的聯(lián)系，為相關(guān)癌癥臨床治療策略的完善提供了參考依據(jù)。結(jié)論：1、成功建立肝癌H22荷瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)采用褪黑素處理能夠明顯降低腫瘤重量和體積，這說明褪黑素可能具有良好的抗腫瘤效果。2、證實(shí)了褪黑素在H22荷瘤小鼠中誘導(dǎo)自噬，能夠誘導(dǎo)自噬過程標(biāo)志蛋白Bec