超聲激活原卟啉對H22小鼠肝癌細(xì)胞線粒體功能的影響.pdf

1、近年來，惡性腫瘤已成為威脅人類生命的頑疾之一。治療腫瘤的方法主要有手術(shù)切除、化學(xué)療法、放射療法、超聲熱療、光動力學(xué)療法、腫瘤免疫療法等，但各種方法均不能單獨成為一種根治腫瘤的手段，綜合治療已逐漸成為治療腫瘤的趨勢。光動力學(xué)療法(PDT)于1978年由美國學(xué)者Doughtery等首先提出，并已應(yīng)用于臨床診治腫瘤。但由于光的穿透能力差，該法主要應(yīng)用于人體表面及淺層腫瘤的治療，而對深部和中晚期腫瘤的治療具有一定的困難。1989年，日本學(xué)者在光

2、動力學(xué)療法的基礎(chǔ)上提出了一種新的抗腫瘤理論一聲動力學(xué)療法(Sonodynamic Therapy，SDT)。該理論主要是利用超聲能穿透深層組織并聚焦于特定的部位，激活富集在此部位的光敏劑產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)從而起到抗癌效果。該法彌補了光動力學(xué)療法只能治療機體淺表腫瘤的局限性，具有更為廣闊的研究價值和臨床應(yīng)用前景。 SDT 作為一種具有重要理論研究意義和臨床應(yīng)用價值的抗腫瘤新思路，倍受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。隨著對聲動力療法研究的不斷深入，科學(xué)家

3、提出了很多理化機制，但對腫瘤細(xì)胞作用的生物學(xué)機制仍在探索中。本實驗室有研究表明，血卟啉可明顯增強超聲對H22腹水腫瘤細(xì)胞的殺傷程度，并且可對H22細(xì)胞造成繼發(fā)性損傷，其作用的敏感位點主要是細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)，其中線粒體是易受損的膜性細(xì)胞器之一。最近本實驗有研究成果表明超聲激活原卟啉對S180腫瘤細(xì)胞有協(xié)同殺傷作用。但是超聲結(jié)合原卟啉對H22腫瘤細(xì)胞的損傷之前尚未有研究。 本論文在前期實驗基礎(chǔ)上，以國家自然科學(xué)基金項目“超聲激活血卟啉

4、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機制”為依托，采用頻率1.80MHz，聲強 1.0W/cm<'2>的聚焦超聲和濃度為0.02mg/ml的原卟啉為實驗參數(shù)，利用臺盼藍(lán)染色，電子顯微鏡觀察，紫外分光光度法，細(xì)胞熒光染色，免疫細(xì)胞化學(xué)等方法，對H22細(xì)胞從細(xì)胞形態(tài)變化，線粒體通透性轉(zhuǎn)換，線粒體跨膜電位改變，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化，及細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累等方面進行實驗研究，所得實驗結(jié)果如下： 1．采用1.0W/cm<'2>的超聲強度，檢測不同超

5、聲(結(jié)合原卟啉)照射時間對H22細(xì)胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)聲照時間不同，細(xì)胞相對存活率也不同。隨著超聲照射時間的增加，超聲組和超聲結(jié)合原卟啉組H22細(xì)胞相對存活率均有所下降；而且在同一聲照時間下，超聲與原卟啉的協(xié)同作用使H22細(xì)胞相對存活率更低。根據(jù)實驗所得數(shù)據(jù)確定聲照時間為30s。 2．超聲強度為1.0W/cm<'2>，聲照時間30s處理腫瘤細(xì)胞。分別于聲照后0、1、2、3、4、5h取材，檢測超聲結(jié)合原卟啉對H22細(xì)胞的殺傷作用。發(fā)

6、現(xiàn)與對照組比較，原卟啉組的H22細(xì)胞相對存活率隨時間變化不大，超聲組和超聲結(jié)合原卟啉組的H22細(xì)胞相對存活率隨著時間的延長而降低。而且在同一時間段取材時，超聲結(jié)合原卟啉對H22細(xì)胞的損傷更嚴(yán)重，同時確定實驗的取材時間為超聲處理后0—5小時。 3．掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)單純超聲對H22腫瘤細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)有一定影響，同等強度超聲結(jié)合原卟啉對腫瘤細(xì)胞的損傷更大，超聲組較超聲結(jié)合原卟啉組的繼發(fā)損傷效應(yīng)要弱；透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)單純超聲及超聲結(jié)合原卟

7、啉對腫瘤細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜、染色質(zhì)及胞質(zhì)密度均有不同程度的損傷，且隨著處理后取材時間的延遲這種損傷效應(yīng)逐漸加劇。并且在超聲結(jié)合原卟啉組處理后3h取材發(fā)現(xiàn)，核膜破裂，核物質(zhì)凝集等細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征。 4．線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔(PTP)在細(xì)胞凋亡過程中通透性會發(fā)生改變，被稱為膜通透性轉(zhuǎn)化(PT)。用紫外分光光度法檢測PTP的開放程度，發(fā)現(xiàn)超聲結(jié)合原卟啉能夠誘導(dǎo)膜通透性轉(zhuǎn)化，線粒體膨脹從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡或凋亡。且這種轉(zhuǎn)化隨取材

8、時間的延遲不可逆。 5．線粒體膜通透性轉(zhuǎn)化可以引起線粒體跨膜電位下降。正常生理狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞具有內(nèi)負(fù)外正的跨膜電位，能夠攝入線粒體外的陽離子染料，當(dāng)這種內(nèi)負(fù)外正的跨膜電位消散時陽離子染料不被攝入。利用陽離子熒光染料羅丹明123標(biāo)記線粒體，激光共聚焦掃描顯微鏡檢測聲動力學(xué)療法對腫瘤細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響，實驗結(jié)果表明超聲激活原卟啉能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞線粒體跨膜電位下降。 6．免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測與凋亡相關(guān)的Bax、Smac、

9、細(xì)胞色素C和caspase-3四種蛋白的動態(tài)表達(dá)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的取材時間里，對照組和原卟啉組的四種蛋白表達(dá)變化不明顯，超聲組和超聲結(jié)合原卟啉組的四種凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)隨取材時間延遲逐漸增強，且同一取材時間超聲結(jié)合原卟啉組較超聲組蛋白表達(dá)量高，二者均顯示出繼發(fā)效應(yīng)。 7．細(xì)胞內(nèi)的活性氧過度積累引起細(xì)胞內(nèi)一系列氧化還原反應(yīng)是凋亡細(xì)胞的一個重要特征。線粒體不僅是活性氧的重要產(chǎn)生部位且是活性氧作用的敏感位點之一。用激光共聚焦掃描顯微