柚皮苷通過激活PI3K-AKT-GLUT4信號通路改善高糖高脂誘導(dǎo)脂肪細胞的胰島素抵抗.pdf

1、目的：驗證柚皮苷是通過PI3K/AKT/GLUT4這條信號通路的作用來改善胰島素抵抗的。這為胰島素抵抗相關(guān)的疾病治療提供理論基礎(chǔ)和潛在靶點，從而為下一步研究疾病的防治策略、治療決策和新藥開發(fā)提供有力的證據(jù)。
　　方法：將3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細胞后，在高糖（葡萄糖）高脂（多種長鏈脂肪酸混合物，即FFAs）的誘導(dǎo)下，將3T3-L1細胞誘導(dǎo)為胰島素抵抗模型。篩選出柚皮苷最佳劑量和孵育時間，將不同劑量（0、5μM、1

2、0μM、25μM、50μM、100μM）的柚皮苷分別加入3T3-L1細胞，將最佳濃度的柚皮苷加入3T3-L1細胞分別孵育0、4小時、8小時、12小時、24小時和48小時，篩選出最佳孵育時間。分別添加抑制劑，將實驗設(shè)為五組：1.正常組；2. IR組；3. IR+柚皮苷組；4. IR+PI3K+柚皮苷組；5. IR+AKT抑制劑+柚皮苷組。在誘導(dǎo)好的胰島素抵抗模型中，依次加入抑制劑LY294002和AKT IV抑制劑，設(shè)置正常對照組（con

3、trol）。使用油紅O染色檢測3T3-L1細胞誘導(dǎo)后，觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)的聚集情況，確認3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化成功。提取脂肪細胞總蛋白，用West ern blo tting法檢測各組細胞內(nèi)AKT、PI3K及其磷酸化蛋白的表達是否上調(diào)或下調(diào)。
　　結(jié)果：⑴油紅O染色顯示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅱ的培養(yǎng)下，經(jīng)過10天，3T3-L1細胞誘導(dǎo)分化成了成熟的脂肪細胞；⑵在濃度為33mmol/L的葡萄糖、0.5mmol/L的棕櫚酸，24小時的

4、孵育時間下，用Western blotting法檢測分化成熟的3T3-L1脂肪細胞內(nèi)AKT磷酸化程度減少，說明成功構(gòu)建胰島素抵抗模型。⑶經(jīng)對劑量和孵育時間的篩選，柚皮苷的最佳劑量為50μg/ml、最佳孵育時間為24小時。⑷加入抑制劑LY294002和AKT IV抑制劑后，用Western blotting法檢測，與control組相比，柚皮柑組PI3K、p-AKT蛋白的表達均下調(diào)，有顯著性差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：本實驗成