雌激素通過(guò)激活雌激素受體β上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及機(jī)制研究.pdf

1、目的：非小細(xì)胞肺癌是目前致死率最高的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，包括我們?cè)趦?nèi)的大量研究證實(shí)雌激素主要通過(guò)激活雌激素受體β（ERβ）促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，其中，已有研究在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)雌激素能顯著促進(jìn) NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移，且顯著促進(jìn)小鼠皮下移植瘤的進(jìn)展，但雌激素是否能通過(guò)激活 ERβ進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)移及其機(jī)制則尚無(wú)報(bào)道?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）已被廣泛認(rèn)為是促進(jìn)惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，且MMP1，MMP2和MMP9在非小細(xì)胞肺癌

2、組織內(nèi)高表達(dá)，但在NSCLC中MMPs與ERβ間的表達(dá)和作用有無(wú)關(guān)聯(lián)，若ERβ能促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移，是否與MMPs相關(guān)也尚無(wú)報(bào)道。為明確雌激素在NSCLC轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用和與MMPs之間的關(guān)系，本研究擬通過(guò)NSCLC組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)多層面探討雌激素是否促進(jìn) NSCLC轉(zhuǎn)移及其機(jī)制為抗雌激素靶向治療晚期非小細(xì)胞肺癌的潛在價(jià)值提供新的依據(jù)。
　　方法：首先通過(guò)免疫組化檢測(cè)222例人NSCLC組織芯片標(biāo)本中ERβ和MMP1

3、、MMP2、MMP9的表達(dá)并分析其相關(guān)性；檢測(cè)30例配對(duì)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)標(biāo)本與NSCLC原發(fā)灶間 ERβ表達(dá)是否存在差異。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)雌激素相關(guān)藥物（雌二醇E2，ERα特異性激動(dòng)劑PPT，ERβ特異性激動(dòng)劑DPN和ER抑制劑Ful）的分別和聯(lián)合干預(yù)NSCLC細(xì)胞A549和H1793，檢測(cè)遷移和侵襲特性的改變以及ERβ和MMPs的蛋白表達(dá)變化；接著通過(guò)siRNA-ERβ沉默或搭載過(guò)表達(dá)ERβ質(zhì)粒載體的干預(yù)調(diào)控ERβ的表達(dá)，進(jìn)一步觀察ERβ

4、對(duì)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移效應(yīng)的影響和機(jī)制，同時(shí)檢測(cè)ERβ、MMPs和下游信號(hào)通路蛋白p38MAPK、AKT表達(dá)情況。最后，利用Balb/c裸鼠建立 A549細(xì)胞體內(nèi)肺癌轉(zhuǎn)移模型并給與上述雌激素相關(guān)藥物干預(yù)，觀察NSCLC轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成情況和上述蛋白的表達(dá)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證雌激素能否促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移和其可能機(jī)制。
　　結(jié)果：人 NSCLC組織芯片-免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=5.666，p值=0.017）和分

5、化程度較低（χ2=4.427，p值=0.035）的NSCLC中 ERβ表達(dá)顯著增高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（2）NSCLC腫瘤組織中 ERβ高表達(dá)與MMP2蛋白高表達(dá)呈正相關(guān)性（p值＜0.001，sperman's rho=0.428）；（3）30例配對(duì) NSCLC患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)灶中 ERβ表達(dá)程度顯著高于 NSCLC原發(fā)灶（t值=4.402,p值<0.001）。
　　體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，（1）在雌激素刺激下，NSCLC細(xì)胞中ERβ和MMP2

6、蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)且呈現(xiàn)時(shí)間梯度和濃度梯度依賴性。（2）在不同雌激素相關(guān)藥物干預(yù)中，E2和DPN實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組表現(xiàn)出遷移和侵襲效應(yīng)的明顯增強(qiáng)，且ERβ與MMP2蛋白表達(dá)水平隨之上升；加入Ful后，E2所引起的侵襲性顯著受到抑制，同時(shí)ERβ與MMP2表達(dá)下降；PPT組不能引起NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲效應(yīng)或相關(guān)蛋白表達(dá)的明顯改變。（3）NSCLC細(xì)胞在受到E2和DPN干預(yù)后下游信號(hào)通路磷酸化蛋白p-p38MAPK和p-AKT蛋白表達(dá)明顯上

7、升，隨后加入Ful之后可明顯抑制其表達(dá)。（4）利用siRNA-ERβ特異性沉默了ERβ表達(dá)后NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲效應(yīng)的下降，同時(shí)伴隨著MMP2，p-p38MAPK和p-AKT蛋白表達(dá)的抑制；而通過(guò)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)ERβ表達(dá)時(shí)反之。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在利用Balb/c裸鼠建立A549細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移瘤模型中發(fā)現(xiàn)：相較于對(duì)照組，E2和DPN干預(yù)組出現(xiàn)了更高的肺濕重（p值＜0.01）、更高的肺結(jié)節(jié)數(shù)（p值=0.021<0.05）和更高

8、的轉(zhuǎn)移指數(shù)（p值＜0.001）；E2+Ful組的成瘤效應(yīng)明顯受到抑制；PPT組沒(méi)有明顯改變；。將肺轉(zhuǎn)移瘤組織提取蛋白行WesternBlot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)E2和DPN干預(yù)組的ERβ、MMP2、p-p38MAPK和p-AKT蛋白表達(dá)上升，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　結(jié)論：從上述研究我們發(fā)現(xiàn)，雌激素能顯著促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能是：雌激素通過(guò)激活ERβ上調(diào)MMP2表達(dá)并激活ERK/MAPK和PI3K/AKT等重要下游信號(hào)通路，阻斷雌