Tat-LK15介導(dǎo)siRNA抑制nNOS表達(dá)治療神經(jīng)病理性疼痛的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)探討離體條件下細(xì)胞穿透肽Tat-LK15介導(dǎo)siRNA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞毒性和干擾效能，為Tat-LK15作為基因載體為介導(dǎo)基因治療提供理論依據(jù)。進(jìn)而探討細(xì)胞穿透肽Tat-LK15介導(dǎo)siRNA干擾大鼠脊髓背角nNOS表達(dá)治療神經(jīng)病理性疼痛的可行性，為神經(jīng)病理性疼痛的基因治療提供新思路新策略。
　　方法：
　　1.細(xì)胞穿透肽Tat-LK15介導(dǎo)siRNA的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性初步研究。根據(jù)Alai

2、n Pluen[15] Tat-LK15序列為RKKRRQRRRGGGKLLKLLLKLLLKLLK，由廈門博欣生物生物科技有限公司合成，檢測(cè)純度為86.59％。通過(guò)與LipofectamineTM RNAiMAX(Lipo)比較，探討細(xì)胞穿透肽Tat-LK15對(duì)人腎上皮細(xì)胞(human embryonic kidney293T cells，293T)和大鼠視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglion cell line，RGC-5)轉(zhuǎn)

3、染siRNA的效率和細(xì)胞毒性。①.Tat-LK15和siRNA以質(zhì)量比為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1混合孵育后經(jīng)20％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過(guò)凝膠阻滯分析測(cè)定Tat-LK15與siRNA的最佳交聯(lián)比。②.以羧基熒光素(Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)標(biāo)記的siRNA為報(bào)告基因，Tat-LK15與siRNA的質(zhì)量比分別為1∶2、3∶4、1∶1、4∶3、2∶1（μg/μg），Lipo與siRNA劑量比分別為1∶

4、1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1（μL/μg），轉(zhuǎn)染293T和RGC-5兩種細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24h后，倒置熒光顯微鏡檢測(cè)FAM顯色并拍照，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率:每孔尋找3個(gè)代表性視野，各觀察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。并以CCK-8法檢測(cè)同等濃度下細(xì)胞存活率評(píng)估Tat-LK15細(xì)胞毒性。
　　2.離體條件下細(xì)胞穿透肽Tat-LK15運(yùn)載siRNA沉默RGC-5細(xì)胞神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)基因的表達(dá)。①.Tat-LK15與FAM-si

5、RNA質(zhì)量比為3∶4、1∶1、2∶1孵育轉(zhuǎn)染RGC-5細(xì)胞，與LipofectamineTM RNAiMAX對(duì)照，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tat-LK15介導(dǎo)FAM-siRNA轉(zhuǎn)染效率;于6孔板中不同劑量Tat-LK15(1μg、2.5μg、5μg、10μg和20μg)孵育RGC-5細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。②.以缺氧缺糖(Oxygen-Glucose Deprivation，OGD)和高鹽(濃度145 mmol·L-1)的處理方式

6、制備nNOS高表達(dá)的細(xì)胞模型。將RGC-5細(xì)胞隨機(jī)分為5組:對(duì)照組、模型組、Tat-S組（Tat-LK15運(yùn)載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞）、Lipo-S組(LipofectamineTM RNAiMAX運(yùn)載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞)及Tat-N組(Tat-LK15運(yùn)載NCsiRNA轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞)，通過(guò)Q-PCR及Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞nNOS在mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　3.細(xì)胞穿透肽Tat-LK15

7、介導(dǎo)siRNA干擾大鼠脊髓背角nNOS表達(dá)治療神經(jīng)病理性疼痛。①.Tat-LK15介導(dǎo)FAM-siRNA轉(zhuǎn)染原代大鼠脊髓背角神經(jīng)元細(xì)胞(RN-dsc)，倒置熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效果。②.健康雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組(n=10):正常組(Control，C組)、假手術(shù)組（Sham組）、神經(jīng)病理性疼痛組（SNL組）、Tat-LK15 nNOS/siRNA組（TS組）和Tat-LK15 NCsiRNA組（TN組）。采用脊神經(jīng)結(jié)扎法(S

8、NL)制作神經(jīng)病理性疼痛模型，C組不予任何處理，Sham組僅暴露脊神經(jīng);SNL組、TS組、TN組構(gòu)建SNL模型同時(shí)鞘內(nèi)置管，于第7d開始每天分別鞘內(nèi)注射10μL生理鹽水、10μL含5μg siRNA的Tat-LK15 nNOS/siRNA和Tat-LK15 NCsiRNA，持續(xù)7天。
　　結(jié)果：
　　1.①.通過(guò)凝膠阻滯分析測(cè)定Tat-LK15與siRNA質(zhì)量比為2∶1時(shí)，Tat-LK15可完全包裹siRNA，達(dá)到最佳交聯(lián)。

9、②.隨著Tat-LK15和Lipo劑量的增加，siRNA轉(zhuǎn)染效率逐漸提高。與凝膠阻滯分析結(jié)果一致，當(dāng)Tat-LK15與siRNA配比為2∶1（μg/μg）時(shí)，RGC-5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高[(87.3±4.5)％]，但低于Lipo與siRNA配比為5∶1（μL/μg）時(shí)的最高轉(zhuǎn)染效率[（96.2±3.2）％(P＜0.05)];作用于293T細(xì)胞時(shí)，兩轉(zhuǎn)染試劑的最高轉(zhuǎn)染效率Tat-LK15(2∶1)轉(zhuǎn)染效率為（93.1±3.0）％與Li

10、po(5∶1)組（98.2±1.6）％沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染試劑劑量增加，Lipo細(xì)胞毒性顯著增加，而Tat-LK15毒性無(wú)明顯變化。轉(zhuǎn)染效率最高時(shí)，Lipo（5μL）組293T和RGC-5的細(xì)胞存活率僅為[（77.8±4.1）％，（73.4±7.7）％]顯著低于Tat-LK15(2∶1)組同種細(xì)胞的存活率[（91.0±3.7）％，(90.0±6.1)％](P＜0.05)。
　　2.①.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，Tat

11、-LK15與FAM-siRNA(50 nmol·L-1)質(zhì)量比為最佳交聯(lián)比2∶1（μg/μg）時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高（84.4±3.9）％，低于Lipo5μL的（95.6±2.4）％(P＜0.05)。當(dāng)Tat-LK15劑量為20μg（6.1μmol·L-1）時(shí)才出現(xiàn)一定細(xì)胞毒性，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組[（10.3±1.1）％vs（7.4±0.9）％，P＜0.05]。②.經(jīng)過(guò)缺氧缺糖高鹽處理后RGC-5細(xì)胞nNOS蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.05)

12、;單純OGD處理nNOS表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)。因此，缺氧缺糖高鹽處理可以得到理想的nNOS高表達(dá)細(xì)胞模型。Tat-LK15 siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞結(jié)果表明:與模型組相比，Tat-S組nNOS mRNA表達(dá)降低63.1％，蛋白表達(dá)降低58.9％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.①經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞特異性物質(zhì)微管相關(guān)蛋白2(MAP2)和DAPI免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定，在熒光倒置顯微鏡下觀察大鼠脊髓背角神經(jīng)元RN-ds

13、c細(xì)胞:結(jié)果顯示RN-dsc神經(jīng)細(xì)胞鑒定純度高;FAM-siRNA綠色熒光廣泛分布，轉(zhuǎn)染效率好。②.鞘內(nèi)注射Tat-LK15 nNOS/siRNA復(fù)合物對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠50％機(jī)械性刺激縮足反應(yīng)閾值(50％PWMT，g)和大鼠熱刺激縮足潛伏期(PWTL)的變化。模型制備前，5組大鼠50％PWMT和PWTL基礎(chǔ)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與假手術(shù)Sham組比較，造模后的SNL組、TN組和TS組在模型之后3～7 d50％PWMT減

14、少（P＜0.01），PWTL縮短（P＜0.01）;正常組C組50％PWMT和PWTL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后7d開始鞘內(nèi)給藥后，與神經(jīng)病理性疼痛模型SNL組比較，鞘內(nèi)注射Tat-LK15-nNOS siRNA的TS組在10～14 d50％PWMT增加(P＜0.01)，PWTL延長(zhǎng)（P＜0.01）;而鞘內(nèi)注射Tat-LK15-NCsiRNA的TN組50％PWMT(P＞0.05)，PWTL（P＞0.05）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tat-LK15-n

15、NOS siRNA復(fù)合物對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角nNOS表達(dá)的影響。與假手術(shù)Sham組比較，制備模型后SNL組脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)，正常大鼠C組脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。鞘內(nèi)給藥后，與神經(jīng)病理性疼痛組SNL組比較，鞘內(nèi)注射Tat-LK15-nNOS siRNA的TS組大鼠脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01);而鞘內(nèi)注射Tat-

16、LK15-NCsiRNA的TN組大鼠脊髓背角nNOSmRNA及其蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.離體條件下，細(xì)胞穿透肽Tat-LK15可以成功介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞，Tat-LK15與siRNA質(zhì)量比2∶1為最佳交聯(lián)比，具有良好的轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞毒性極低，安全優(yōu)勢(shì)突出。細(xì)胞穿透肽Tat-LK15可成功介導(dǎo)nNOS siRNA轉(zhuǎn)染RGC-5神經(jīng)細(xì)胞并干擾nNOS的過(guò)度表達(dá)，所以Tat-LK15

17、可以作為運(yùn)載siRNA干擾神經(jīng)細(xì)胞nNOS表達(dá)的有效工具。并且Tat-LK15可高效介導(dǎo)nNOS siRNA轉(zhuǎn)染原代大鼠脊髓背角神經(jīng)元細(xì)胞。
　　2.SNL神經(jīng)病理性疼痛大鼠50％機(jī)械性刺激縮足反應(yīng)閾值(50％PWMT,g)和大鼠熱刺激縮足潛伏期(PWTL)均明顯降低;鞘內(nèi)注射Tat-LK15-nNOSsiRNA復(fù)合物，可顯著抑制SNL神經(jīng)病理性疼痛大鼠的50％機(jī)械性刺激縮足反應(yīng)閾值(50％PWMT,g)和大鼠熱刺激縮足潛伏期(P