p300介導(dǎo)調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛因子CO2-2的表觀遺傳學(xué)研究.pdf

1、研究背景：
　　神經(jīng)病理性疼痛是指由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的疼痛，主要以痛覺過敏、感覺異常、自發(fā)性疼痛等為特征。全世界約有3％的人正在遭受神經(jīng)病理性疼痛的困擾，然而由于目前人們對神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知仍然有限，且缺乏有效的治療手段，往往導(dǎo)致患者的病情得不到緩解，因此完善對神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知并探索有效的治療措施，一直是疼痛研究領(lǐng)域函待解決的難題。表觀遺傳學(xué)是指基于非基因序列改變所導(dǎo)致的基因表達(dá)水平變

2、化，即通過DNA甲基化、組蛋白乙?；头蔷幋aRNA控制等方式對基因進(jìn)行調(diào)控。p300是一個具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有豐富的表達(dá)。目前的研究證實(shí)，p300與神經(jīng)細(xì)胞的激活有關(guān)，它可以通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制介導(dǎo)大量下游基因的轉(zhuǎn)錄。通過干預(yù)p300進(jìn)而調(diào)控下游疼痛基因的轉(zhuǎn)錄很可能成為治療神經(jīng)病理性疼痛的一個新途徑。
　　研究目的：
　　構(gòu)建大鼠慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎（chronic constricti

3、on injury，CCI）模型，通過觀察各組大鼠的疼痛行為學(xué)改變，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300在脊髓水平的動態(tài)變化以及在各類神經(jīng)細(xì)胞中的定位，探索p300在神經(jīng)病理性疼痛中的潛在作用;采用特異性的小發(fā)卡RNA(specificsmall hairpin RNA，shRNA)下調(diào)p300的表達(dá)和小分子抑制劑C646化學(xué)抑制p300的轉(zhuǎn)移酶活性，觀察CCI大鼠的疼痛行為學(xué)改變，并檢測下游疼痛相關(guān)因子環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2

4、，COX-2)的表達(dá)水平變化，探索p300參與神經(jīng)病理性疼痛的潛在表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.將雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為正常組（na(i)ve組）、假手術(shù)組（sham組）和CCI組。測量各組大鼠的熱痛閾和機(jī)械性痛閾基礎(chǔ)值后，按照Bennett和Xie的方法建立大鼠左側(cè)CCI神經(jīng)病理性疼痛模型，sham組僅暴露坐骨神經(jīng)不行結(jié)扎。分別在術(shù)后第3、7、14、21天對各組大鼠行熱痛閾、機(jī)

5、械痛閾檢測并取大鼠脊髓腰膨大部分保存，分別檢測p300的蛋白表達(dá)水平，在脊髓背角的形態(tài)表達(dá)變化和在各類神經(jīng)細(xì)胞中的定位，探索其在神經(jīng)病理性疼痛當(dāng)中的潛在作用。
　　2.為了研究抑制p300后能否減輕神經(jīng)病理性疼痛，鞘內(nèi)置管成功的大鼠被隨機(jī)分為4組:假手術(shù)+生理鹽水組、CCI+生理鹽水組、CCI+慢病毒甾體陰性對照組(lentiviral vectors encoding smallinterfering RNA as the ne

6、gative control，LV-NC)、CCI+慢病毒甾體組(lentiviral vectors encoding small interfering RNA of p300 gene,LV-shp300)。分別于CCI術(shù)后第7天鞘內(nèi)注射生理鹽水，生理鹽水，LV-NC和LV-shp30010μl。同時在CCI術(shù)前，術(shù)后第3、5、7、10、12、14天測定各組大鼠的熱痛閾值和機(jī)械痛閾值，于術(shù)后第14天處死大鼠取脊髓腰膨大部分行慢病毒

7、甾體轉(zhuǎn)染效率檢測、p300和COX-2的表達(dá)水平檢測，p300和COX-2相互作用的檢測等。
　　3.選取鞘內(nèi)置管成功的大鼠隨機(jī)分為3組: CCI+二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)組、CCI+C37（646的類似對照物）組、CCI+646組。分別于CCI術(shù)后第7天起開始鞘內(nèi)注射10％DMSO，C37和C646（溶于10％DMSO）10μl。同時在CCI術(shù)前，術(shù)后第3、5、7、10、12、14天測定各組大

8、鼠的熱痛閾值和機(jī)械痛閾值，于術(shù)后第14天處死大鼠取脊髓腰膨大部分行p300和COX-2的表達(dá)水平檢測，p300和COX-2相互作用的檢測等，進(jìn)一步探索p300的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性對神經(jīng)病理性疼痛的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.正常組、sham組和CCI組大鼠術(shù)前基礎(chǔ)熱痛閾值和機(jī)械性痛閾值無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。術(shù)后第3天，CCI組的熱痛閾和機(jī)械痛閾值較sham組和正常組明顯下調(diào)(P＜0.05)，術(shù)后第7天趨于穩(wěn)定狀態(tài)

9、(P＜0.05)，一直持續(xù)至術(shù)后第21天(P＜0.05)。western blot檢測結(jié)果表明p300脊髓表達(dá)水平從CCI術(shù)后第3天起至術(shù)后第21天都明顯升高（P＜0.05 vs.正常組和sham組），其中CCI術(shù)后第14天達(dá)到最高值。免疫組化檢測示p300陽性細(xì)胞主要表達(dá)在灰質(zhì)，在脊髓背角Ⅰ-Ⅲ層表達(dá)較致密;陽性顆粒主要位于細(xì)胞核，可見少量也位于細(xì)胞漿。在各組的表達(dá)趨勢類似于前面的western blot結(jié)果。免疫熒光雙標(biāo)表明p300

10、陽性細(xì)胞主要定位于神經(jīng)元，在膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞未見明顯表達(dá)。
　　2.在CCI術(shù)后第7天鞘內(nèi)給予慢病毒甾體LV-shp300后，LV-shp300組大鼠在給藥后第3天熱痛閾值和機(jī)械性痛閾值相比LV-NC組和CCI+生理鹽水組有所緩解，在給藥后第5天和第7天疼痛行為學(xué)顯著減輕(P＜0.05)。p300和COX-2的mRNA、蛋白和組織表達(dá)水平檢測顯示CCI+生理鹽水組和LV-NC組相比假手術(shù)+生理鹽水組，p300和COX-2的表達(dá)

11、水平明顯升高(P＜0.05)，而LV-shp300組相比CCI+生理鹽水組和LV-NC組明顯下調(diào)(P＜0.05)。ChIP表明CCI+生理鹽水組和LV-NC組相比假手術(shù)+生理鹽水組p300在COX-2基因啟動子區(qū)招募增加(P＜0.05)，而經(jīng)LV-shp300抑制表達(dá)后，p300在COX-2基因啟動子區(qū)招募水平明顯下降(P＜0.05)。p300和COX-2免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明它們的陽性顆粒都共存于神經(jīng)元，進(jìn)一步證明它們之間的相互作用。H

12、E染色表明鞘內(nèi)給予慢病毒甾體對大鼠脊髓組織無明顯損傷。
　　3.在CCI術(shù)后第7天鞘內(nèi)給予p300乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑C646后，C646組大鼠在給藥后第3天熱痛閾值和機(jī)械性痛閾值有所緩解（P＜0.05 vs.DMSO組和C37組），在給藥后第5天和第7天疼痛行為學(xué)顯著減輕(P＜0.05)。COX-2的mRNA、蛋白和組織表達(dá)水平檢測顯示C646組相比DMSO組和C37組，COX-2的表達(dá)水平明顯受到抑制(P＜0.05)。ChIP表明

13、C646組相比DMSO組和C37組p300在COX-2基因啟動子區(qū)招募減少(P＜0.05)。HE染色表明鞘內(nèi)給予C646或C37對大鼠脊髓組織無明顯損傷。
　　結(jié)論：
　　1.p300主要在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)，神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓p300表達(dá)增加。
　　2.鞘內(nèi)注射LV-shp300可以緩解CCI誘導(dǎo)的疼痛行為學(xué)改變，調(diào)控并降低下游神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)因子COX-2的表達(dá)，提示脊髓p300可能通過上調(diào)COX-2基因參與神經(jīng)病