TLR4、MD2及CD14介導IL-6和TNF-α在早產分娩發(fā)動中的作用研究.pdf

1、目的：研究早產自然分娩、足月自然分娩及足月?lián)衿谄蕦m產產婦外周血單個核細胞TLR4、MD2及CDl4 mRNA的表達水平，探討TLR4、MD2和CDl4表達與早產及亞臨床絨毛膜羊膜炎的關系。
　　 方法：選擇2008年8月-2009年5月，我院產科住院的早產自然分娩組(28周-36+6周)20例，足月妊娠自然分娩組(37周-41+6周)28例，足月?lián)衿谄蕦m產組(38+5周-41周)10例。收集每位受試對象抗凝的外周血2ml(自然分

2、娩組活躍早期采集標本，剖宮產組術前采集標本)，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血中單個核細胞。應用逆轉錄聚合酶鏈反應( reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）檢測外周血中TLR4、MD2、CD14mRNA的表達，并通過同一產婦胎盤HE染色，觀察TLR4、MD2、CD14的表達與亞臨床絨毛膜羊膜炎的關系。
　　 結果：
　　 1.三組產組外周血均可

3、檢測到TLR4、MD2、CD14的表達。自然分娩組產婦進入活躍期后外周血TLR4、MD2、CD14mRNA高表達，早產自然分娩組TLR4mRNA(0.41±0.17)、MD2mRNA(0.39±0.20)表達水平明顯高于足月自然分娩組TLR4mRNA(0.18±0.85)、MD2mRNA(0.22±0.13)表達水平（p

4、p=0.42>O.05)。早產及足月自然分娩組TLR4、MD2、CD14mRNA表達均高于足月剖宮產組，早產自然分娩組與足月剖宮產組比較均有統(tǒng)計學差異(p0.05；而CD14表達有統(tǒng)計學差異，p<0.05。
　　 2.20例早產自然分娩產婦有14例(70％)為亞絨毛膜羊膜炎患者；28例足月自然分娩產婦有9例(32.14％)為亞絨毛膜羊膜炎患者；

5、10例足月剖宮產產婦有2例(20％)為亞絨毛膜羊膜炎患者。妊娠合并亞臨床絨毛膜羊膜炎組較妊娠無亞I臨床絨毛膜羊膜炎組，外周血中TLR4、MD2、CD14mRNA表達水平高，差異具有統(tǒng)計學意義(P　　 3.相關分析發(fā)現(xiàn)，孕婦外周血中TLR4、CD14、MD2mRNA表達水平，

6、兩兩之間均存在正相關關系。TLR4與MD2、TLR4與CD14、MD2與CD14表達的相關系數(shù)(r)分別為O.719、0.525、0.488，p　　 結論：
　　 1.早產自然分娩產婦，尤其合并亞臨床絨毛膜羊膜炎時外周血TLR4、MD2表達最高，提示可能與早產及感染有關。
　　 2.外周血中CDl4在自然分娩組表達均高于剖宮產組，但在自然分娩兩組間無統(tǒng)計學差異，且在合并亞臨床絨毛膜羊膜炎時表達增加，

7、提示CDl4可能與分娩發(fā)動及感染有關。
　　 目的：
　　 研究 TLR4、MD2及CDl4在胎盤組織不同部位的分布及表達。探討其在早產分娩中的意義。
　　 方法：采用免疫組化技術檢測三組產婦胎盤組織TLR4、MD2、CD14的表達及分布情況，并觀察TLR4、MD2、CD14表達與早產及亞臨床絨
　　 結果：
　　 1.免疫組化結果表現(xiàn)為：TLR4主要表達于胎盤合體滋養(yǎng)細胞、合體細胞小結、絨毛外滋

8、養(yǎng)細胞及羊膜細胞的胞漿和胞膜，胞核表達陰性；MD2主要表達于胎盤合體滋養(yǎng)細胞、合體細胞小結、絨毛間Hofbauer細胞、絨毛外滋養(yǎng)細胞及羊膜細胞的胞漿、胞膜及胞核，其中胞核表達強陽性；CD14分布較前兩者稍有差異，主要表達于胎盤合體滋養(yǎng)細胞及羊膜細胞的胞漿、胞膜，胞核表達陰性；還可表達于血管內皮細胞，但絨毛外滋養(yǎng)細胞表達陰性。
　　 2.TLR4、：MD2、CD14在胎盤合體滋養(yǎng)細胞及羊膜細胞表達，早產自然分娩組表達強于足月自然

9、分娩組，兩兩比較均有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。兩組均表達強于足月剖宮產組。但TLR4蛋白表達在足月自然分娩組和剖宮產組間無統(tǒng)計學差異(p>0.05)，其余兩兩比較均有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。
　　 3.TLRH、MD2及CD14在羊膜細胞分布具有極性。足月剖宮產組羊膜細胞中TLR4、MD2及CD14主要分布在羊膜細胞母體面，但早產自然分娩組和足月自然分娩組中TLR4、MD2及CD14在羊膜細胞的分布大都極性基本消失，表現(xiàn)為

10、胞漿表達陽性。
　　 4.絨毛外滋養(yǎng)細胞表達TLR4、MD2，表達強弱在足月剖宮產組、足月自然分娩組和早產自然分娩組依次增強，組間比較均有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。CD14在絨毛外滋養(yǎng)細胞表達陰性。
　　 5.TLR4、MD2、CDl4在妊娠合并亞臨床絨毛膜羊膜炎組表達高于妊娠無亞臨床絨毛膜羊膜炎組，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。妊娠合并亞臨床絨毛膜羊膜炎組TLR4、MD2及CD14在羊膜細胞的分布大都極性消失。

11、
　　 6.胎盤組織的TLR4、MD2、CD14的表達成正相關：胎盤合體滋養(yǎng)細胞TLR4與MD2、TLR4與CD14、MD2與CD14的相關系數(shù)(r)分別為0.831、0.831、0.718，p

12、4表達陰性)。
　　 7.TLRH在外周血及胎盤合體滋養(yǎng)細胞的表達具有正相關性，相關系數(shù)r=0.885，p<0.01；MD2及CD14在外周血及胎盤合體滋養(yǎng)細胞的表達亦具有正相關性，相關系數(shù)r分別為0.636，0.512，p<0.01。
　　 結論：
　　 1.胎盤中合體滋養(yǎng)細胞、羊膜細胞均可檢測到TLR4、MD2、CD14的表達。而絨毛外滋養(yǎng)細胞只有TLR4、MD2表達，CD14表達陰性。
　　 2.胎

13、盤中TLR4、MD2及CD14的表達及分布與早產和感染有關，且羊膜細胞的TLR4、MD2及CD14分布具有極性，分娩發(fā)動和感染的情況下極性消失。
　　 3.外周血及胎盤合體滋養(yǎng)細胞的TLR4、MD2、CD14表達具有正相關性，提示外周血的表達情況能反映胎盤部位的表達程度。
　　 目的:
　　 通過體外滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)，利用中和性TLR4抗體阻斷TLR4技術，研究TLR4、MD2及CD14在LPS刺激反應中對IL-6、

14、TNF-α表達水平的影響。
　　 方法：
　　 1.分離培養(yǎng)人足月胎盤的絨毛膜滋養(yǎng)細胞，用不同濃度純化LPS刺激培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞不同時間，通過檢驗培養(yǎng)細胞TLR4mRNA(RT-PCR)和培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α水平(ELISA法)，得到刺激最大炎癥反應的最有效LPS濃度(10 ng/ml)和最佳時間(12 h)。
　　 2.將TLR4抗體(H-80)加入到胎盤培養(yǎng)液中，預處理后，再加入LPS(最有效濃度10

15、 ng/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)到反應最佳時間(12 h)。利用RT-PCR和Western blot技術分別檢驗刺激后TLR4、MD2、CD14的mRNA、蛋白表達的差異，并用ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中促炎因子的變化情況以研究TLR4、MD2、CD14在LPS誘導炎癥反應中的作用及生物學功能。
　　 結果：
　　 1.原代培養(yǎng)的絨毛膜滋養(yǎng)細胞表達TLR4、MD2和CD14，LPS孵育刺激可使其表達明顯增強，伴隨細胞培養(yǎng)上清液

16、中促炎因子IL-6、TNF-α增加。
　　 2. LPS刺激后，TLR4mRNA和培養(yǎng)液上清液中促炎因子IL-6、TNF-α.僅隨作用時間延長表達增加，12 h達到高峰，繼續(xù)延長時間反而出現(xiàn)表達下降。
　　 3.1 ng/ml濃度的LPS即可引起TLR4mRNA和促炎因子表達顯著增加，此后隨著LPS濃度的增高，表達繼續(xù)增加，當LPS濃度達到10ng/ml時，繼續(xù)增加LPS濃度，TLR4 mRNA和上清液中IL-6、TNF

17、-α表達未見增加，反而下降。
　　 4. TLR4、MD2、CD14mRNA和蛋白表達在LPS組、阻斷組和對照組變化一致，表現(xiàn)為LPS組細胞TLR4、MD2和CD14 mRNA和蛋白表達最高，與阻斷組、對照組相比較，其差異均有統(tǒng)計學意義(P