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1、單核及巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞,通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子等調(diào)節(jié)對(duì)入侵病原體的反應(yīng),但是過(guò)強(qiáng)的反應(yīng),尤其是嚴(yán)重創(chuàng)傷及大手術(shù)后等,機(jī)體的免疫機(jī)能下降的情況下,可出現(xiàn)膿毒癥(Sepsis)、膿毒性休克.高達(dá)50﹪的膿毒癥病人是由革蘭陰性菌感染所致,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),即內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的主要致病成分;極微量?jī)?nèi)毒素即可使機(jī)體首先通過(guò)天然免疫系統(tǒng)對(duì)其做出反應(yīng).機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)LPS 的識(shí)別機(jī)制極為復(fù)
2、雜,1990年發(fā)現(xiàn)的CD14是LPS的識(shí)別受體,但由于CD14分子沒(méi)有跨膜部分,自身不能將信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),還需要其它膜結(jié)合分子協(xié)同作用.TLR4及MD-2蛋白的發(fā)現(xiàn)是對(duì)LPS受體識(shí)別機(jī)制研究的突破性進(jìn)展,MD-2與TLR4的胞外區(qū)相偶聯(lián),因其是一個(gè)只含有160個(gè)氨其酸的分泌蛋白,具有分子量小,核酸片段短,且為可分泌型等特點(diǎn),對(duì)MD-2的調(diào)控更易于操作,因而成為治療內(nèi)毒素休克十分有潛力的靶點(diǎn)之一.研究其在內(nèi)毒素跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及其與T
3、LR4、CD14之間的關(guān)系,是確定對(duì)MD-2進(jìn)行調(diào)控有無(wú)深遠(yuǎn)意義的基礎(chǔ).LPS對(duì)人外周血單核巨噬細(xì)胞的活化有賴于其受體基因的表達(dá)譜,雖然有一些對(duì)CD14,TLR4基因表達(dá)受LPS調(diào)節(jié)的報(bào)道,但報(bào)道的結(jié)果并不一致,且很少有對(duì)MD-2基因受LPS調(diào)節(jié)的報(bào)道;更沒(méi)有同時(shí)報(bào)道MD-2/TLR4/CD14基因在同一標(biāo)本內(nèi)受LPS調(diào)節(jié)的研究.核糖核酸酶保護(hù)法是一種可同時(shí)在同一標(biāo)本內(nèi)檢測(cè)多種基因表達(dá)的先進(jìn)方法,且其重復(fù)性、客觀性都較強(qiáng),但是需要構(gòu)建相
4、關(guān)基因的檢測(cè)模板組,因而該研究率先構(gòu)建了該檢測(cè)模板組,并成功地應(yīng)用于檢測(cè)人外周血單核細(xì)胞上關(guān)注的三種基因的表達(dá).為進(jìn)一步明確MD-2在單核細(xì)胞LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用,可以通過(guò)增強(qiáng)或抑制其功能的方式,檢測(cè)細(xì)胞LPS信號(hào)功能的變化,從而反映其作用,并為確定可否做為調(diào)控靶點(diǎn)提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)的依據(jù).通過(guò)基因轉(zhuǎn)染的方法將MD-2或其功能突變體導(dǎo)入受體細(xì)胞,可使細(xì)胞增強(qiáng)表達(dá)MD-2或阻抑MD-2的功能.因而,我們首先根據(jù)相關(guān)報(bào)道,成功地構(gòu)建了MD-2
5、的功能失活表達(dá)載體,而后將正常功能的MD-2表達(dá)載體及新構(gòu)建的功能突變體導(dǎo)入人單核細(xì)胞株THP1內(nèi),觀察對(duì)LPS效應(yīng)的影響.為明確MD-2所起的作用的機(jī)制及其與TLR4及CD14之間的關(guān)系,通過(guò)觀察它們與LPS的結(jié)合能力及不同組合的轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)LPS的不同反應(yīng)能力,以探討MD-2發(fā)揮其作用的可能機(jī)制.因此擬從以下三部分進(jìn)行研究:1.分離提取人外周血單核細(xì)胞,以LPS刺激,核糖核酸酶保護(hù)法檢測(cè)MD-2、TLR4、CD14 mRNA表達(dá)變化的
6、規(guī)律.2.構(gòu)建MD-2功能突變體,將正常功能的MD-2及其功能失活突變體轉(zhuǎn)染進(jìn)單核細(xì)胞株THP1內(nèi),以LPS刺激后,觀察細(xì)胞活化功能的變化,以此反映MD-2在LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中所起的作用.3. 將以上三種基因表達(dá)質(zhì)粒以不同組合轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,而后應(yīng)用LPS刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察細(xì)胞NF-kB被活化的改變,及熒光素標(biāo)記的LPS與轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合能力,以此來(lái)探討MD-2發(fā)揮其作用的可能機(jī)制.主要結(jié)果及結(jié)論如下:一、成功地構(gòu)建了用于核糖核酸酶保
7、護(hù)法的模板組:為在基因水平檢測(cè)MD-2/TLR4/CD14表達(dá)變化奠定了基礎(chǔ).核糖核酸酶保護(hù)法具有靈敏度高,穩(wěn)定性及重復(fù)性好等特點(diǎn),因而構(gòu)建了該模板組,并成功地用于檢測(cè)人外周血單核細(xì)胞上述三種基因的表達(dá).二、人外周血單核細(xì)胞上述三種基因的表達(dá)規(guī)律:人外周血單個(gè)核細(xì)胞在受到LPS刺激后,TLR4, MD-2, CD14 mRNA在刺激后15min~30min即可以明顯增加,在1-3h則有一過(guò)性降低,之后恢復(fù).檢測(cè)結(jié)果提示:細(xì)胞作為對(duì)LPS
8、的反應(yīng),迅即增強(qiáng)相關(guān)受體基因的表達(dá),但作為機(jī)體自我保護(hù)的一種反應(yīng),為避免過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng),能反饋性的適當(dāng)抑制和調(diào)節(jié)LPS受體基因的表達(dá).另外,因三者的表達(dá)豐度存在明顯的差異,由于缺乏更多的證據(jù),我們只能推測(cè)表達(dá)最低的MD-2可能在LPS信號(hào)中具有更為特異的作用.三、構(gòu)建了MD-2功能突變體:根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,在人MD-2蛋白分子的第95位氨基酸,在由半胱氨酸突變?yōu)槔野彼岷蠊δ苁Щ?我們應(yīng)用PCR定點(diǎn)突變的方法成功地構(gòu)建了該突變體.四、MD
9、-2可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)能力:轉(zhuǎn)染正常功能的MD-2表達(dá)載體后,THP1細(xì)胞NF-κB活性及細(xì)胞上清內(nèi)TNF-α分泌增強(qiáng).相反,轉(zhuǎn)染MD-2的功能突變體后,LPS對(duì)THP1細(xì)胞激活效應(yīng)明顯減弱,表現(xiàn)為NF-κB活性及TNF-α分泌明顯降低.進(jìn)一步提示,MD-2在LPS對(duì)單核細(xì)胞的激活效應(yīng)中具有重要的地位,而且有望成為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的靶點(diǎn)之一.五、MD-2可明顯增強(qiáng)細(xì)胞經(jīng)TLR4對(duì)LPS的結(jié)合能力:單獨(dú)或以各種不同的組合方式將三種受
10、體基因轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞內(nèi),以FITC-LPS與細(xì)胞共同孵育,應(yīng)用流式細(xì)胞儀的方法進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)MD-2可以直接與LPS結(jié)合,雖然這種結(jié)合能力較低,但是卻可以明顯促進(jìn)LPS與TLR4及CD14的結(jié)合.六、在LPS對(duì)細(xì)胞NF-kB的活化過(guò)程中,需要MD-2/TLR4/CD14三種分子的共同參與.雖然MD-2可明顯促進(jìn)TLR4與LPS的結(jié)合,且TLR4/MD-2共同轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對(duì)LPS有較強(qiáng)的結(jié)合能力,但是與三種基因共同轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比,細(xì)
11、胞活化程度較低.沒(méi)有跨膜蛋白TLR4的參與,CD14/MD-2也有一定強(qiáng)度的與LPS的結(jié)合能力,可是細(xì)胞卻不能被LPS活化.同樣,沒(méi)有MD-2的調(diào)節(jié)作用,轉(zhuǎn)染TLR4/CD14的細(xì)胞與LPS的結(jié)合能力僅及單獨(dú)轉(zhuǎn)染CD14的細(xì)胞,更不能被LPS所活化.提示在LPS跨膜信號(hào)傳導(dǎo)中,MD-2及TLR4為必不可少的蛋白分子;只有在三種蛋白分子同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞膜時(shí),才能達(dá)到最大的信號(hào)活化強(qiáng)度;推測(cè)MD-2蛋白可能作為一種調(diào)節(jié)分子,能改變跨膜蛋白TL
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