靶向MD-2抗炎多肽的篩選及其對(duì)TLR4活化的阻抑作用研究.pdf

1、研究背景和目的： 在臨床醫(yī)生日常工作中所面對(duì)的許多疾病的病理生理機(jī)制中，炎癥反應(yīng)都起著十分重要的作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，住院病人發(fā)生膿毒血癥的比例是1/3，ICU病人＞50％，外科ICU＞80％。值得注意的是，即使廣泛使用抗生素，膿毒癥仍然是臨床ICU病人死亡的重要原因。近來認(rèn)識(shí)到病情惡化與病原體胞壁成分的釋放對(duì)機(jī)體的過度炎癥性刺激有關(guān)。而拮抗過度的炎癥反應(yīng)則是當(dāng)前臨床診斷和治療工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。 既往，人們通常采用大劑量的抗生

2、素對(duì)膿毒癥進(jìn)行治療，但其臨床療效并不明顯，同時(shí)抗生素的耐藥性問題隨之而來。經(jīng)過最近10余年的研究，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，無論是過度炎癥反應(yīng)或是免疫功能低下，創(chuàng)傷后病原微生物的侵入在創(chuàng)傷后免疫功能紊亂的發(fā)生發(fā)展中具有極為重要的作用，免疫功能低下易并發(fā)感染，而感染的出現(xiàn)又是SIRS快速進(jìn)展成為MODS的最主要原因，因此針對(duì)感染的免疫治療逐漸受到人們的重視。 膿毒癥(Sepsis)的本質(zhì)是機(jī)體對(duì)侵入機(jī)體病原微生物所產(chǎn)生的過度炎癥性反應(yīng)，此外

3、機(jī)體損傷后大量破碎的組織和細(xì)胞同樣可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生過度的炎癥性損害。通常而言，炎癥損傷后由于腸道菌的移位，特別是細(xì)菌內(nèi)毒素通過腸粘膜屏障進(jìn)入血循環(huán)，促發(fā)免疫炎癥細(xì)胞的過度活化則被認(rèn)為是膿毒癥發(fā)生的主要機(jī)制。LPS進(jìn)入體內(nèi)后，與免疫炎癥細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合，是啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生防御反應(yīng)及由此而形成膿毒性反應(yīng)或膿毒癥的關(guān)鍵。 目前針對(duì)感染的免疫調(diào)理措施主要包括：拮抗炎癥介質(zhì)的生物學(xué)活性，抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)，阻斷炎癥反應(yīng)的啟

4、動(dòng)等方面。 在過去的10年中，人們嘗試了多種拮抗措施控制炎癥反應(yīng)，包括單克隆抗體等方法，試圖抑制炎癥介質(zhì)的活性，但由于炎癥介質(zhì)眾多，對(duì)其逐一拮抗無疑事倍功半；于此同時(shí)，人們也在試圖從炎癥細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的角度探討其臨床治療措施，如針對(duì)p38MAPK的拮抗劑，針對(duì)NF-κB的拮抗劑等，但存在的問題主要有兩方面，其一炎癥細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路甚為復(fù)雜，通常阻斷一條通路后，機(jī)體能很快建立另外的活化通路繼續(xù)將炎癥刺激信號(hào)向下轉(zhuǎn)導(dǎo)，其二，如何將拮抗

5、劑有效地通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞漿，同時(shí)還必須避免細(xì)胞溶酶體對(duì)拮抗劑的清除作用。因而，這在很大程度上限制了這一治療策略的應(yīng)用。此外，NF-κB不僅是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而且還是維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)所必須的核因子，對(duì)其阻斷所帶來的副作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了對(duì)炎癥反應(yīng)拮抗的本身。 因而，近年來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到如何在早期就對(duì)炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)實(shí)施有效的阻抑，可能才是控制炎癥反應(yīng)的最合理的途徑。 機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)LPS的識(shí)別機(jī)制極為復(fù)雜，1990

6、年發(fā)現(xiàn)的CD14是LPS的識(shí)別受體，但由于CD14分子是一個(gè)膜表面的錨定糖蛋白，缺乏跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，自身不能將信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，還需要Toll樣受體4(TLR4)及髓樣分化蛋白-2(MD-2)的協(xié)同作用，才能將細(xì)菌產(chǎn)物的刺激信號(hào)向胞內(nèi)傳遞。隨后，機(jī)體通過一系列的復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化，最終導(dǎo)致NF—κB的活化，并釋放大量的炎癥介質(zhì)，形成SIRS及Sepsis。 資料表明，LPS與巨噬細(xì)胞膜TLR4和MD-2的結(jié)合是啟動(dòng)

7、巨噬細(xì)胞活化的關(guān)鍵因素。MD-2與TLR4的胞外區(qū)相偶聯(lián)，因其是一個(gè)只含有160個(gè)氨基酸的分泌蛋白，具有分子量小，且為可分泌型等特點(diǎn)，對(duì)MD-2的調(diào)控更易操作，應(yīng)該成為治療內(nèi)毒素休克十分有潛力的靶點(diǎn)之一。MD2具有兩個(gè)重要的功能域，分別同TLR4和LPS結(jié)合，其中K128/132是MD-2與LPS結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。因此，從理論上說，如果干預(yù)MD-2或TLR與LPS的結(jié)合，則可以阻斷或抑制病原體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞，從而達(dá)到抵御或減輕病原菌所

8、導(dǎo)致的過度炎癥損傷的目的。 為此，本研究中我們?cè)O(shè)想：通過人工合成MD-2與LPS結(jié)合的功能活性結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵序列即“MD-2模擬肽”，并采用噬菌體展示技術(shù)，以“MD-2模擬肽”為靶，篩選出MD-2結(jié)合肽，而這種MD-2結(jié)合肽即可封閉MD2與LPS結(jié)合的位點(diǎn)，從而選擇性阻斷或部分阻斷MD-2與LPS的結(jié)合，達(dá)到阻斷或減輕病原體對(duì)免疫細(xì)胞過度刺激的目的。 主要技術(shù)方法： 采用多種生物軟件和互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器，設(shè)計(jì)并合成“MD

9、-2模擬肽”；以“MD-2模擬肽”為靶，通過噬菌體隨機(jī)肽庫篩選和細(xì)胞因子生成抑制篩選，獲得具有抗炎效應(yīng)的MD-2結(jié)合多肽；驗(yàn)證MD-2結(jié)合多肽與全長MD-2間存在相互作用；最后通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)MD-2結(jié)合多肽的拮抗炎癥效應(yīng)進(jìn)行初步驗(yàn)證。 主要結(jié)果和結(jié)論： 一、本研究對(duì)MD-2進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析，采用多種生物軟件和互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器，分析MD-2的氨基酸序列，預(yù)測(cè)MD-2的功能，尋找可能與MD-2作用

10、的蛋白質(zhì)。其中K128/132是LPS結(jié)合功能域的關(guān)鍵氨基酸，可能是MD-2與LPS結(jié)合的分子基礎(chǔ)，根據(jù)親水性預(yù)測(cè)，以K128—K132為中心的肽段呈現(xiàn)較強(qiáng)的親水性，即NH2-FSKGKYKCV-COOH，我們將此段序列作為“MD-2的模擬肽”，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論支持和指導(dǎo)。 二、利用噬菌體隨機(jī)肽庫篩選技術(shù)，以“MD-2模擬肽”為靶，經(jīng)過三輪篩選，獲得15條針對(duì)“MD2模擬肽”的結(jié)合多肽。本研究應(yīng)用親和富集法對(duì)噬菌體環(huán)7肽庫進(jìn)行

11、3輪親和篩選，以“MD-2模擬肽”為靶，每一輪都不斷減少“MD-2模擬肽”的用量及蛋白與肽庫作用時(shí)間，同時(shí)不斷增加Tween-20的濃度，目的在于篩選得到高親和力、特異性強(qiáng)的噬菌體克隆。均采用MD-2競爭性洗脫，這樣得到的噬菌體克隆可與MD-2競爭性結(jié)合。三輪篩選后挑選藍(lán)色單斑擴(kuò)增，PEG沉淀回收噬菌體。此外，本實(shí)驗(yàn)中以鏈霉親和素作為對(duì)照，經(jīng)三輪富集/擴(kuò)增后，得到鏈霉親和素結(jié)合肽的共有保守序列為HPQ，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明本篩選技術(shù)是完

12、全可行及有效的。隨機(jī)挑取15個(gè)克隆，并測(cè)序。 三、利用細(xì)胞因子生成抑制實(shí)驗(yàn)篩選到3條有一定抑炎效應(yīng)的MD-2結(jié)合多肽，命名為MD2-CP1，MD2-CP2，MD2-CP3。我們以上得到的15個(gè)噬菌體克隆僅僅是能與MD-2相結(jié)合的多肽，并不代表它們一定具有拮抗炎癥的作用。因此，我們進(jìn)一步采用培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，并以LPS刺激后細(xì)胞因子的抑制實(shí)驗(yàn)來篩選具有抗炎效應(yīng)的MD-2結(jié)合多肽。結(jié)果表明：巨噬細(xì)胞經(jīng)15條噬菌體克隆干預(yù)后，有3條能顯著

13、降低細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)(P＜0.01)。為此，將上述3條具有抗炎效應(yīng)的MD-2結(jié)合多肽人工合成，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 四、利用生物素標(biāo)記驗(yàn)證了2條結(jié)合多肽與全長MD-2間確實(shí)存在相互作用。利用sulfo-SBED復(fù)合物所具有的四個(gè)特性：可同特異氨基酸序列反應(yīng)，非特異光反應(yīng)性，可被硫醇裂解的二硫鍵以及可與生物素結(jié)合。生物素標(biāo)記轉(zhuǎn)移法正是利用Sulfo—SBED的特性，利用NHS活化酯首先使一種蛋白與Sulfo—SBED結(jié)

14、合，使其成為“誘餌蛋白”，在避光條件下將“誘餌”蛋白與待分析的“獵物”蛋白共同孵育，待二者結(jié)合后，通過300-350nm紫外光照射，以活化Sulfo—SBED的疊氮基苯，使“誘餌”蛋白與“獵物”蛋白之間形成共價(jià)連接，此時(shí)，利用硫醇裂解二硫鍵后，生物素標(biāo)記即可從“誘餌”蛋白轉(zhuǎn)移到“獵物”蛋白上，最后采用WesternBlot方法將二者分離，通過檢測(cè)蛋白上標(biāo)記的鏈親酶素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶即可對(duì)“誘餌”蛋白是否捕獲到待分析的“獵物”蛋白進(jìn)行

15、確定。結(jié)果證實(shí)有2條結(jié)合多肽與MD-2全長蛋白發(fā)生結(jié)合作用。 五、體外實(shí)驗(yàn)表明3條結(jié)合多肽有一定的抗炎效應(yīng)：采用3種巨噬細(xì)胞模型，即人淋巴瘤細(xì)胞株(U937)、人前單核細(xì)胞株(THP-1)和人外周血單核細(xì)胞(peripheralmonocyte，PMc)，分別將上述3種細(xì)胞與3條MD-2結(jié)合多肽共同培養(yǎng)，并由LPS刺激，其細(xì)胞上清液經(jīng)ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明3條MD-2結(jié)合肽均能顯著減少LPS刺激后巨噬細(xì)胞TNFα和IL-6的分