抗TLR4納米抗體制備及其對革蘭陰性菌膿毒癥大鼠模型的作用研究.pdf

1、目的：膿毒癥流行病學(xué)調(diào)查研究顯示全球每年有1800萬膿毒癥患者，死亡率高達(dá)30％~50%，如并發(fā)感染性休克，患者的病死率可高達(dá)80％。因此，探索膿毒癥發(fā)病機(jī)制，研究膿毒癥的拮抗藥物或治療措施，對膿毒癥患者的救治具有重要的意義。細(xì)菌、病毒、真菌及寄生蟲等都可以引起膿毒癥的發(fā)生，而革蘭陰性菌仍是膿毒癥發(fā)生的主要因素，侵入血中革蘭陰性菌大量繁殖、死亡崩解釋放的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），在胞外經(jīng)一系列信號傳遞，最

2、終通過TLR4將信號傳遞到胞內(nèi)，引起炎癥因子的釋放，因而TLR4是LPS誘發(fā)膿毒癥的樞紐，在膿毒癥發(fā)生中發(fā)揮了重要作用，也成為膿毒癥治療藥物研究的重要靶點(diǎn)。目前有關(guān)TLR4的抗體研究表明通過抑制TLR4能夠抑制炎癥因子的釋放及降低動物的死亡率，然而，傳統(tǒng)單克隆抗體存在組織穿透能力弱、生產(chǎn)成本及臨床應(yīng)用價(jià)格高昂等問題，在一定程度上限制了單克隆抗體的臨床應(yīng)用。基于駱駝重鏈抗體發(fā)現(xiàn)而開展的納米抗體研究，為抗體藥物進(jìn)行疾病診斷、治療提供新的途徑

3、。不同于傳統(tǒng)四鏈抗體（包含兩條重鏈和兩條輕鏈），駱駝重鏈抗體在輕鏈缺失的情況下單獨(dú)存在，同時(shí)駱駝重鏈抗體的可變區(qū)（Variable domain ofthe heavy chain, VHH）單個結(jié)構(gòu)同樣能夠結(jié)合抗原，展示出良好的抗體活性，其結(jié)構(gòu)呈橢圓形，直徑2.5nm,高4nm，由于其大小在納米物質(zhì)規(guī)定的100nm內(nèi)，因此將駱駝重鏈抗體VHH也稱為納米抗體（Nanobody, Nb）。納米抗體由于具有分子小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、組織穿透能力強(qiáng)、

4、可溶性高、易于制備、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，展示了很好的應(yīng)用前景。基于納米抗體應(yīng)用方面的優(yōu)勢及TLR4在介導(dǎo)膿毒癥LPS信號傳遞過程中的重要作用，本研究擬通過TLR4胞外區(qū)抗原表達(dá)純化、噬菌體抗體庫展示技術(shù)，進(jìn)行抗TLR4納米抗體的制備，并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)LPS、細(xì)菌性膿毒癥模型實(shí)驗(yàn)，探討抗TLR4納米抗對膿毒癥大鼠的保護(hù)作用。
　　方法：⑴TLR4結(jié)構(gòu)分析，選擇TLR4胞外區(qū)，通過基因擴(kuò)增、載體構(gòu)建技術(shù)將TLR4的胞外區(qū)構(gòu)建到原

5、核表達(dá)載體 pET28a，通過純化得到高純度 TLR4胞外區(qū)（ex-TLR4）。⑵將純化TLR4胞外區(qū)作為免疫原，于第0、14、28、42、56、70、84天，皮下多點(diǎn)抗原注射500μg/次，進(jìn)行駱駝免疫，免疫后第7天采血進(jìn)行抗體效價(jià)檢測。采集高效價(jià)免疫駱駝外周血并分離淋巴細(xì)胞，擴(kuò)增VHH，將VHH構(gòu)建到pCantab-5E噬菌體展示系統(tǒng)，電轉(zhuǎn)入TG1宿主菌，并計(jì)算庫容。⑶ex-TLR4包被進(jìn)行四輪淘洗，從第四輪淘洗后的納米抗體庫中隨機(jī)

6、挑取60個克隆，ex-TLR4包被，噬菌體 ELISA篩選，將篩選到的陽性克隆，利用前期純化的TLR4中間結(jié)構(gòu)域（TI）、TLR4 C端結(jié)構(gòu)域（TC）繼續(xù)二次篩選，獲得的陽性克隆，轉(zhuǎn)化HB2151宿主菌，乳糖自動誘導(dǎo)進(jìn)行納米抗體的表達(dá)、純化，獲得納米抗體分別命名為：TI-Nbs、TC-Nbs。⑷體外通過LPS對NR8383細(xì)胞的刺激，加入制備的抗TI、TC結(jié)構(gòu)域納米抗體，ELISA觀察納米抗體對脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子（TNF-α、 I

7、L-6）釋放的影響。⑸體內(nèi)分別通過LPS和革蘭陰性菌細(xì)菌模型，觀察抗TI、TC納米抗體對動物存活率的影響。
　　結(jié)果：①選擇TLR4胞外區(qū)序列，成功構(gòu)建表達(dá)載體并獲得高純度的胞外區(qū)蛋白。②ex-TLR4免疫駱駝，四次免疫后效價(jià)達(dá)到1:128000，采集外周血淋巴細(xì)胞， VHH構(gòu)建到pCantab-5E噬菌體展示系統(tǒng)建庫，庫容可達(dá)109。③抗體庫經(jīng)四輪淘洗，第三輪富集倍數(shù)達(dá)到147倍，第四輪富集3.1倍，四輪淘選后抗體庫達(dá)到富集，經(jīng)

8、ex-TLR4篩選獲得16個陽性克隆，TI、TC二次篩選分別獲得5個、7個陽性克隆，獲得陽性克隆進(jìn)一步自動誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體和可溶兩種形式存在，可溶性表達(dá)產(chǎn)物純化后純度>90%。④脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型，獲得針對TI的5個和TC的7個陽性克隆中，每組分別有3個和4個陽性克隆具有抑制細(xì)胞炎癥因子釋放的作用，抗TI納米抗體抑制效果優(yōu)于抗TC納米抗體，兩個納米抗體的協(xié)同作用能進(jìn)一步降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。⑤選取細(xì)胞活性中和作用最強(qiáng)的

9、納米抗體進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，LPS炎癥模型組，抗TI、TC納米抗體多次、聯(lián)合給藥的治療效果優(yōu)于單個納米抗體、單次給藥的治療。細(xì)菌性膿毒癥模型，進(jìn)一步證實(shí)了兩個納米抗體多次、聯(lián)合給藥的方式，能夠降低TNF-α、IL-6炎癥因子的釋放，并提高大鼠的存活率。
　　結(jié)論：膿毒癥的本質(zhì)是機(jī)體對感染性因素引起的過度免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致大量炎癥因子釋放和組織器官損傷，這一反應(yīng)一旦觸發(fā)即按照自身規(guī)律發(fā)展，并不不依賴感染因素，膿毒癥的發(fā)生

10、與否以及嚴(yán)重程度完全取決于機(jī)體的反應(yīng)。病原體入侵機(jī)體時(shí)，依靠模式識別受體發(fā)揮防御作用，TLRs是天然免疫的主要“開關(guān)”。目前的研究表明，LPS可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞 TLR4基因表達(dá)上調(diào)，而上調(diào)的TLR4又作為新的受體介導(dǎo)更多的細(xì)胞活化和炎癥介質(zhì)的釋放，在這種正反饋下，炎癥反應(yīng)不斷放大，最終導(dǎo)致發(fā)展為膿毒癥。本研究通過蛋白表達(dá)、純化的方式獲得TLR4胞外區(qū)抗原，噬菌體展示抗體庫制備技術(shù)獲得抗TLR4 C端和中間結(jié)構(gòu)域的納