TLR4mAb對膿毒癥小鼠急性肺損傷保護作用的研究.pdf

1、研究目的：
　　 本研究通過建立膿毒癥小鼠急性肺損傷模型，測定各組小鼠肺組織含水量、肺組織Toll樣受體4mRNA(Toll like receptor4 mRNA,TLR4mRNA)的表達、炎癥因子TNF-a和IL-6的表達，觀察肺組織病理形態(tài)學的變化；探討TLR4單克隆抗體(TLR4mAb)對膿毒癥小鼠肺臟的保護作用及其可能的機制。
　　 材料與方法：
　　 1、實驗分組
　　 健康雄性BALB/c小

2、鼠45只(體重19～23g)，隨機分成對照組(15只)、膿毒癥組(15只)和治療組(15只)。用腹腔注射給藥方法，膿毒癥組注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)5mg/kg；治療組注射LPS5mg/kg+TLR4mAb100ug/只；對照組注射等量生理鹽水。各組動物按照觀察時間點平均分為造模后6h、12h和24h各3個亞組。
　　 2、模型制作
　　 用0.1％的戊巴比妥鈉4ml/kg作腹腔內(nèi)注射麻醉

3、后，將小鼠于仰臥位固定。用腹腔注射給藥方法，注射LPS5mg/kg，制備膿毒癥急性肺損傷模型。
　　 3、檢測指標和方法
　　 在造模后6h、12h和24h時點處死相應實驗組的小鼠，快速分離右肺中葉組織，測定其肺組織含水量。快速分離右肺下葉經(jīng)4％多聚甲醛固定12～16h，制成石蠟切片，H.E染色，光學顯微鏡下觀察標本形態(tài)學變化。分離左肺組織，應用RT-PCR方法檢測TLR4mRNA的表達。分離右肺上葉，組織切塊(約1mm

4、×1mm×2mm)投入2.5％戊二醛固定液固定后，電鏡觀察。制備小鼠右肺上葉組織勻漿，檢測炎癥因子TNF-a。小鼠眼底靜脈取血，離心取上清，檢測炎癥因子IL-6。
　　 4、統(tǒng)計學處理
　　 本研究的數(shù)據(jù)采取SPSS16.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，實驗資料均以均數(shù)±標準差(x±S)表示；多組間比較用方差分析；對于不同處理組的兩兩比較，利用LSD-t法檢驗。以p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　

5、　 1、肺組織含水量
　　 在6h時點各組肺組織含水量無顯著差異(P＞0.05)；在12h和24h時點各組肺組織含水量，膿毒癥組＞治療組＞對照組，各組肺組織含水量有顯著差異(p＜0.01)。
　　 2、肺組織TNF-a表達的變化
　　 在6h、12h和24h時點上，膿毒癥組小鼠肺組織炎癥因子TNF-a的表達高于治療組(p＜0.01)和對照組(p＜0.01)；治療組小鼠肺組織炎癥因子TNF-a的表達高于對照組(P

6、＜0.05)。膿毒癥組和治療組肺組織TNF-α的表達在6h達高峰，隨后隨著建模時間的延長，肺組織TNF-α的表達逐漸減少；同一組內(nèi)各時點之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3、血清IL-6表達的變化
　　 在6h、12h和24h時點上，膿毒癥組小鼠血清炎癥因子IL-6的表達高于治療組(P＜0.01)和對照組(P＜0.01)；治療組小鼠血清炎癥因子IL-6的表達高于對照組(p＜0.05)。膿毒癥組和治療組隨

7、著建模時間的延長，小鼠血清炎癥因子IL-6的表達逐漸增高，24h達到高峰；各時點之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 4、肺組織TLR4mRNA表達的變化
　　 TLR4mRNA在肺正常組織中表達為0.304±0.03，在LPS誘導的膿毒癥小鼠肺組織中的表達增加，6h達到高峰，為1.697±0.090，12h后有所下降，為1.280±0.083，到24 h已降低到0.913±0.093(p＜0.05 vs.

8、對照組)。TLR4mAb可降低TLR4mRNA在膿毒癥小鼠肺組織中的表達(p＜0.05 vs.膿毒癥組)，在6h、12h、24h分別為1.201±0.053，0.921±0.049和0.404±0.051。
　　 5、肺組織光鏡下的變化
　　 對照組小鼠在6h、12h和24h病理檢測均無明顯的肺損傷病理改變；膿毒癥組小鼠在造模6h和12h右肺下葉組織病理改變主要為肺泡擴張不均勻，部分肺泡萎陷，肺泡壁增厚，肺泡壁毛細血管擴

9、張、充血，間質(zhì)多量多形核細胞浸潤，隨著時間的延長，病變程度可見加重；膿毒癥組小鼠在造模24h右肺下葉組織除了上述病變外，還出現(xiàn)輕微的小氣道損傷、輕微肺水腫及局部肺出血。治療組小鼠在造模6h、12h和24h右肺下葉組織病理改變較模型組減輕。
　　 6、肺組織電子顯微鏡下的變化
　　 對照組肺部組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡上皮細胞形態(tài)常。膿毒癥組肺泡上皮細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡、細胞器腫脹、細胞器溶解等壞死表現(xiàn)，以及核染色質(zhì)邊集、核碎裂、核膜破

10、裂等凋亡表現(xiàn)；同時可見肺微血管基底膜增厚，細胞間隙水腫，肺泡壁增厚及毛細血管擴張，肺間質(zhì)水腫，紅細胞及中性粒細胞浸潤等表現(xiàn)。隨著建模時間的延長，上述表現(xiàn)逐漸加重，肺泡間隔增寬斷裂，肺泡腔內(nèi)大量的紅細胞及中性粒細胞浸潤。治療組與膿毒癥組相比，肺泡上皮細胞壞死和凋亡比例相對較少，肺水腫及細胞浸潤現(xiàn)象相對較輕。
　　 結(jié)論：
　　 1.腹腔內(nèi)注射LPS可成功建立膿毒癥小鼠急性肺損傷模型。
　　 2.TLR4、TNF-α