線粒體肌病非編碼RNA表達(dá)譜研究及潛在分子標(biāo)志物篩選.pdf

1、線粒體DNA(mtDNA)或/和編碼線粒體功能相關(guān)蛋白的核DNA發(fā)生基因缺失或點突變，造成編碼線粒體氧化代謝必需的酶或載體發(fā)生障礙，糖原和脂肪酸等不能進(jìn)入線粒體充分利用，導(dǎo)致能量代謝障礙和產(chǎn)生復(fù)雜的臨床癥狀稱為線粒體疾病(mitochondrial disease)。線粒體疾病骨骼肌受累者稱為線粒體肌病(mitochondrial myopathy)。線粒體肌病涉及臨床類型復(fù)雜，包括線粒體肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(MELAS)綜合征

2、等多種臨床綜合征，不同臨床類型往往具有不同致病基因突變但亦有重疊。圍繞線粒體與疾病及衰老、細(xì)胞程序性死亡、氧自由基生成以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控過程中的相互關(guān)系的研究一直是線粒體醫(yī)學(xué)的研究熱點。
　　基因測序的進(jìn)步讓我們意識到，人類基因組存在著數(shù)以萬計的多種雖不具有編碼蛋白的功能但具有基因調(diào)控和表觀遺傳修飾功能的非編碼RNA(ncRNA)，如微小非編碼RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lnc

3、RNA)。近年來ncRNAs已被證明可以通過多種不同機制影響基因的表達(dá)水平，但絕大多數(shù)非編碼RNA的功能還是未知的。更為復(fù)雜的是各類RNA分子相互間存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。得益于核酸測序等技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多研究發(fā)現(xiàn)在人類血清/血漿中存在大量穩(wěn)定的ncRNA。非編碼RNA分子具備可以作為疾病生物學(xué)標(biāo)志物的各類特征，有巨大潛力成為線粒體肌病等疾病的診治標(biāo)志物。
　　線粒體功能相關(guān)ncRNA的研究還只是處于起步階段，ncRNA如何影響

4、線粒體基因表達(dá)及其功能是一個全新的領(lǐng)域。越來越多的研究證實非編碼RNA可以通過影響核基因編碼線粒體相關(guān)蛋白基因表達(dá)或直接在線粒體中調(diào)節(jié)線粒體自身基因表達(dá)影響線粒體的功能。目前線粒體功能相關(guān)非編碼RNA研究仍大多局限在體外線粒體損傷細(xì)胞模型相關(guān)非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)及功能驗證。盡管已發(fā)現(xiàn)多種影響線粒體功能的miRNAs和lncRNAs，但ncRNA調(diào)控線粒體功能詳細(xì)機制有待進(jìn)一步闡明。ncRNA與線粒體肌病的相關(guān)研究尚未見報道，我們有必要探究

5、ncRNA參與線粒體肌病發(fā)生發(fā)展的的詳細(xì)機制，或能更深入地揭示ncRNA與線粒體功能的密切聯(lián)系，且為線粒體肌病找到潛在的治療靶點。我們希望能在ncRNA調(diào)控層面，在線粒體肌病中發(fā)現(xiàn)調(diào)控線粒體功能或者參與線粒體肌病致病機制的某些關(guān)鍵ncRNAs，進(jìn)而可以通過影響ncRNA實現(xiàn)異常線粒體的有效清除等影響線粒體肌病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病理過程的調(diào)控。具備疾病診治標(biāo)志物特征的ncRNA分子具備還可以作為線粒體肌病診治標(biāo)志物服務(wù)臨床。
　　為此，

6、本課題通過篩選線粒體肌病患者肌肉組織和血清中與健康對照者差異表達(dá)的ncRNA(miRNA/lncRNA)，構(gòu)建不同RNA之間相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探索ncRNA參與線粒體肌病發(fā)生發(fā)展的潛在通路及線粒體損傷對關(guān)鍵性lncRNA的表達(dá)調(diào)控機制，并尋找線粒體肌病發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵ncRNA(miRNA/lncRNA)，為ncRNA用于線粒體肌肉病的診斷和治療提供前期理論依據(jù)。本課題圍繞著線粒體病非編碼RNA參與線粒體肌病發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機制進(jìn)行了以下

7、幾方面的工作:
　　第一部分線粒體肌病肌肉非編碼RNA(miRNA/lncRNA)差異表達(dá)譜研究
　　研究目的
　　采用高通量技術(shù)結(jié)合后續(xù)RT-PCR重復(fù)性驗證的前期篩選策略，篩選代表性線粒體腦肌病MELAS（A3243G突變患者）肌肉組織中非編碼RNA(miRNA/lncRNA)的差異表達(dá)譜，為后續(xù)尋找感興趣的ncRNA以及探究非編碼RNA參與線粒體肌病的復(fù)雜機制提供前期基礎(chǔ)。
　　研究對象和方法
　　1

8、)首先選取MELAS（A3243G突變患者）及活檢排除肌肉病變的對照者各20例，采用miRNA表達(dá)譜芯片和lncRNA高通量測序技術(shù)，篩選MELAS(A3243G突變患者)相比對照肌肉組織中非編碼RNA(miRNA/lncRNA)差異表達(dá)譜。
　　2)由于高通量技術(shù)結(jié)果存在潛在假陽性及假陰性，通過RT-PCR對篩選出的關(guān)鍵差異非編碼RNA(miRNA/lncRNA)及mRNA再次驗證。再次在上述MELAS（A3243G突變患者）及

9、活檢排除肌肉病變的對照者各20例單個肌肉樣本中進(jìn)行RT-PCR實驗驗證高通量初篩結(jié)果，確認(rèn)關(guān)鍵性ncRNAs(miRNAs、lncRNAs)及相關(guān)靶mRNAs在MELAS（A3243G突變患者）肌肉組織中的表達(dá)差異。
　　實驗結(jié)果
　　1.我們首次發(fā)現(xiàn)MELAS A3243G突變患者肌肉組織中獨特的ncRNAs(miRNAs/lncRNAs)表達(dá)譜，共篩選出具有2倍以上差異的microRNAs(31個上調(diào);41個下調(diào))，ln

10、cRNAs(57個上調(diào);52個下調(diào))以及mRNAs（167個上調(diào);162個下調(diào)）;2種線粒體肌?。╩DNA A3243G突變與核基因TK2突變）肌肉組織顯示二者共有41個共差異表達(dá)的mRNAs。
　　2.我們通過對篩選出的6個miRNAs（miR-6089、miR-27b-3p、miR-214-3p、miR-150-5p、let-7e-5p和miR-145-5p）、5個lncRNAs(LINC01405、SNHG12、RP11-4

11、03P17.4、CTC-260E6.6和RP11-357D18.1)和6個mRNAs(PDK4、CDKN1A、ATP2A2、SOD3、DDIT4和EEF1A1)進(jìn)行RT-PCR驗證，結(jié)果顯示同高通量測序結(jié)果比較二者基本一致。
　　第二部分線粒體肌病肌肉差異RNA分子互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵ncRNA(miRNA/lncRNA)篩選
　　研究目的
　　構(gòu)建mRNA及非編碼RNA(miRNA/lncRNA)相互間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并分析

12、其參與的信號通路建立調(diào)節(jié)機制假說。
　　研究方法
　　對差異ncRNA(miRNA/lncRNA)進(jìn)行生物信息學(xué)（聚類及GO和Pathway分析）、表達(dá)相關(guān)性等分析確定參與不同突變類型線粒體肌病患者發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵非編碼RNA(miRNA/lncRNA)相互作用分子。共表達(dá)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建包括miRNA-mRNA、miRNA-lncRNA及l(fā)ncRNA-mRNA兩兩互作網(wǎng)絡(luò)以及miRNA-mRNA-lncRNA和mRNA-miRN

13、A-lncRNA三分子互作網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Cytoscape軟件計算網(wǎng)絡(luò)及各節(jié)點的拓?fù)涮匦?。通過miRecords預(yù)測差異miRNA的靶基因，對差異靶基因進(jìn)行GO功能注釋、KEGG通路分析。
　　實驗結(jié)果
　　1.我們首次通過生物信息學(xué)靶基因預(yù)測構(gòu)建出miRNA-mRNA-lncRNA和mRNA-miRNA-lncRNA共表達(dá)互作網(wǎng)絡(luò)，篩選出調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵性ncRNA分子。
　　2.GO分析發(fā)現(xiàn)差異miRNA/lncRNAs

14、靶基因集合及總體差異mRNAs集合共同的生物過程富集分析集中于細(xì)胞外基質(zhì)分子、肌肉收縮和蛋白結(jié)合分子。除此之外，總的差異表達(dá)mRNAs的顯著GO條目富集結(jié)果集中于小分子代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄分子等過程;miRNA靶mRNA網(wǎng)絡(luò)代表的顯著GO分類條目為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、細(xì)胞凋亡相關(guān)分子等;lncRNA靶mRNA對應(yīng)的相關(guān)聯(lián)的GO分析富集條目為小分子代謝過程和肌肉收縮相關(guān)分子。KEGG通路分析表明這些失調(diào)的mRNA主要參與小分子代謝過程、細(xì)胞外基

15、質(zhì)生成、肌肉收縮、蛋白結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄等信號途徑和生物功能。綜上所述，MELAS患者mtDNA A3243G突變造成的下游差異表達(dá)的ncRNA譜可能通過免疫應(yīng)答、小分子代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡和發(fā)育過程等多種信號途徑參與線粒體肌病的發(fā)生發(fā)展。
　　第三部分線粒體肌病ncRNA(miRNA/lncRNA)生物學(xué)標(biāo)志物的潛在臨床應(yīng)用價值
　　研究目的
　　本課題進(jìn)一步分析關(guān)鍵性ncRNAs在肌肉組織和血清對MELAS患者的

16、診斷效能，尋找線粒體肌病潛在的ncRNA診斷標(biāo)志物。
　　研究對象和方法
　　1.選取54例MELAS(A3243G突變患者)與49例正常對照組獨立肌肉樣本再次驗證A3243G突變MELAS患者高通量結(jié)果;
　　2.選取34例MELAS(A3243G突變患者)與34例對照獨立血清樣本驗證A3243G突變MELAS患者miR-27b-3p表達(dá);
　　3.選取22例MELAS（非A3243G突變患者）與34例對照獨立

17、肌肉及血清樣本驗證非A3243G突變MELAS患者miR-27b-3p表達(dá);
　　3.軟件分析肌肉組織ncRNAs及血清miR-27b-3p對于MELAS患者診斷的敏感度、特異度;對血清miRNA-27b-3p表達(dá)水平與各類臨床參數(shù)如年齡、性別、BMI、NMDAS、疾病持續(xù)時間、血乳酸和肌肉A3243G突變率進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　實驗結(jié)果
　　1.我們再次證實4個ncRNAs(miR-6089、miR-27b-3p、m

18、iR-214-3p及LINC01405)肌肉表達(dá)顯著下調(diào)，而7個ncRNAs(miR-150-5p、let-7e-5p、miR-145-5p、SNHG12、RP11-403P17.4、CTC-260E6.6及RP11-357D18.11)在MELAS肌肉組織巾顯著上調(diào);ROC曲線分析表明在所選擇的肌肉組織關(guān)鍵性ncRNA中miR-27b-3p對于MELAS患者診斷具有最高的靈敏度和特異性。
　　2.關(guān)鍵性miR-27b-3p在ME

19、LAS患者（A3243G和非A3243G突變患者）肌肉和血清中表達(dá)均降低。
　　3.ROC曲線分析表明，相比乳酸血清miR-27b-3p對于MELAS具有更好的診斷價值。相關(guān)性分析顯示血清miR-27b-3p和乳酸鹽及NMDAS之間存在顯著負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論
　　我們首次發(fā)現(xiàn)MELAS A3243G突變患者肌肉組織中獨特的ncRNAs(miRNAs/lncRNAs)表達(dá)譜;首次構(gòu)建出miRNA-mRNA-lncRNA和