胃癌標志物血漿非編碼小RNA的篩選及其在腫瘤免疫中的作用及機制.pdf

1、胃癌是我國第二大常見的腫瘤，高居腫瘤相關死亡率的第二位。即使采取積極的治療，中晚期患者的5年生存率仍不足30％。腫瘤的進展及其對治療的反應受免疫系統(tǒng)的影響，腫瘤細胞與免疫細胞的相互作用決定了腫瘤的轉歸。
　　樹突狀細胞（dendritic cells,DCs）是免疫反應的啟動者，雙重調控抗腫瘤免疫反應及腫瘤免疫逃逸。腫瘤微環(huán)境中 DCs介導的免疫反應類型取決于與腫瘤細胞相互作用后DCs的成熟狀態(tài)。成熟DCs高表達共刺激分子及抗原呈

2、遞分子，刺激 T細胞增殖和分化，促進抗腫瘤免疫反應，而未成熟DCs抗原呈遞功能障礙，分泌免疫抑制性因子，并通過誘導 T細胞無能和調節(jié)性T細胞（regulatory T cell,Treg）擴增，促進腫瘤免疫逃逸。目前認為腫瘤細胞通過下調抗原，或分泌免疫抑制性因子阻礙 DCs的成熟，介導腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤進展。
　　非編碼小RNA(small non-coding RNAs,snRNAs)是一類不編碼蛋白質，直接以RNA形式在轉

3、錄前或轉錄水平調控編碼基因的RNA,目前對snRNAs的功能研究主要集中在微小RNA(micro RNAs,miRNAs)和piwi結合RNAs(piwi-interacting RNAs,piRNAs)上。SnRNAs高度穩(wěn)定，保存10年的甲醛固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）組織與新鮮組織的miRNA表達譜無明顯差異。體液中也可檢出大量的snRNAs，它們源于多種組織細胞，并作

4、為細胞間信息傳遞的介質，調節(jié)細胞間的物質交換。研究發(fā)現，胰腺癌細胞可以分泌富含miR-212-3p的外泌體，將其與DCs共培養(yǎng)后，DCs中MHC-II表達下降，介導免疫耐受。這一結果提示，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤來源的miRNAs可被DCs攝取，參與腫瘤免疫的調節(jié)。
　　胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，伴隨著細胞內外snRNAs表達譜的變化。與健康受試者相比，胃癌患者外周血中單核細胞來源的DCs中MHC-II及HLA-DR表達明顯減少，提示成熟

5、受阻，而成熟DCs的組織浸潤與患者術后的無病生存期及總生存期呈正相關。胃癌微環(huán)境中 DCs的成熟狀態(tài)是否與胃癌細胞來源的snRNAs有關，目前尚無文獻報道。此外，腫瘤分泌入血的snRNAs還可用于腫瘤的無創(chuàng)診斷及病情監(jiān)測。已有研究通過大樣本的逐步驗證證實了snRNAs作為胃癌診斷標記物的可行性，但大部分只關注了胃癌患者外周血中snRNAs的表達，忽視了其來源，因此這些標記物并不能完全反應腫瘤組織中胃癌細胞的代謝情況。
　　本研究旨

6、在通過對FFPE組織及血漿樣本進行高通量測序，篩選出胃癌細胞分泌的snRNAs，驗證其作為胃癌診斷標志物的可行性。觀察其是否能作為信號分子被DCs攝取，調節(jié)其功能，進而影響腫瘤免疫，為胃癌的診斷及治療提供新的理論依據。具體實驗分為以下三個部分：
　　第一部分：胃癌診斷標志物血漿非編碼小RNA的篩選
　　目的：
　　了解snRNAs在組織及血漿樣本中的表達特征，篩選出胃癌的標記物，并建立基于snRNAs的胃癌診斷模型。<

7、br>　　方法：
　　收集82例胃癌患者血漿樣本，82例健康對照血漿樣本；另收集8對胃癌患者腫瘤組織及其癌旁對照的FFPE樣本。首先對2對混合的血漿樣本和2對混合的組織樣本分別進行深度測序，其中混合樣本來自8對（I-IV期各2對）相應組織；然后在82對血漿樣本中應用實時定量PCR(qRT-PCR)技術對候選snRNAs進行驗證，并應用Kruskal-Wallis檢驗和Dunn-Bonferroni檢驗分析snRNAs表達量與臨床分

8、期的關系；最后，應用二分類Logistic回歸分析建立胃癌的診斷模型，并應用 ROC曲線檢測snRNAs對胃癌的診斷效能。
　　結果：
　　1.非編碼小RNA高通量測序結果分析
　　1.1.原始測序數據的片段長度分布
　　本研究對送檢標本中長度為18-35 nt的RNA進行了測序，FFPE樣本的小RNA長度分布區(qū)間為20-36 nt，有兩個峰值，分別位于22 nt和32 nt附近，說明存在明顯的miRNAs及pi

9、RNAs富集；血漿樣本中的小RNA長度分布區(qū)間為10-32 nt，單個峰值出現在21 nt附近，說明只有miRNAs的明顯富集。
　　1.2.原始測序數據的序列種類及數量
　　胃癌及癌旁的FFPE標本中，與數據庫比對上的已知miRNAs分別有6473種和4236種，分別占所有注釋小RNA種類的0.92%和0.83%，占其數量的33.11%和24.19%，說明測序樣品中的miRNAs種類較少，但表達水平較高；在胃癌及健康體檢人

10、群的血漿標本中，上述特征更加明顯，miRNAs分別有2466種和2609種，分別占所有注釋小RNA種類的0.98%和0.92%，卻占其數量的40.36%和54.79%。
　　與miRNA相比，與現有數據庫比對上的piRNAs的種類及數量極少。
　　1.3.非編碼小RNA的差異表達分析
　　在FFPE及血漿樣本中差異表達的snRNAs分為以下4種，在胃癌的FFPE及血漿樣本中均升高的snRNAs(31個，均為miRNAs

11、)，在兩種樣本中均下降的snRNAs(1個，為miRNA),在胃癌FFPE樣本中升高而在血漿樣本中下降的snRNAs(4個，3個miRNAs和1個piRNA)，在胃癌的FFPE樣本中下降而在血漿樣本中升高的snRNAs(4個，均為miRNAs)。
　　2.胃癌相關非編碼小RNA的驗證及其對胃癌的診斷價值
　　2.1.胃癌相關非編碼小RNA的篩選與驗證
　　本研究重點關注在胃癌的FFPE及血漿樣本中均升高的31個miRN

12、As。本課題組前期研究應用qRT-PCR技術在23對胃癌FFPE標本及42對血漿標本中對這31個miRNAs進行了逐一的驗證，結果證實共有5個miRNAs(miR-17-5p,miR-127-3p,miR-379-5p,miR-433-3p,miR-654-3p)的表達趨勢與測序結果一致。
　　為了驗證其在人群中作為腫瘤標記物的可能性，本研究進一步擴大樣本至82例，應用qRT-PCR技術檢測胃癌患者及其健康對照的血漿樣本中5種mi

13、RNAs的表達水平。結果顯示5種miRNAs在胃癌患者血漿中的相對表達量均顯著升高，提示其可能成為胃癌診斷的腫瘤標記物。
　　2.2.5種miRNAs與胃癌臨床分期的關系
　　miR-17-5p，miR-379-5p，miR-433-3p，miR-654-3p在各期胃癌血漿樣本中的表達水平均較健康對照組顯著升高，但這4種miRNAs在胃癌各期之間的表達水平無顯著性差別，提示其在胃癌早期即達到較高水平，這一高表達狀態(tài)在胃癌進展

14、過程中一直持續(xù)；miR-127-3p在I、II、III期胃癌患者血漿中的表達水平有顯著性升高，在IV期胃癌患者血漿中的表達量下降，與健康對照間無統(tǒng)計學差異，提示miR-127-3p的分泌在IV期胃癌可能受到抑制。
　　2.3.單個miRNA對胃癌的診斷價值
　　繪制受試者工作曲線，miR-17-5p,miR-127-3p,miR-379-5p,miR-433-3p,miR-654-3p的曲線下面積分別為0.82(95% CI

15、:0.75-0.88),0.78(95%CI:0.71-0.85),0.81(95%CI:0.74-0.88),0.78(95%CI:0.71-0.85),0.76(95%CI:0.69-0.83),提示這5個miRNAs均具有較好的診斷胃癌的效能，其中以miRNAs-17-5p的診斷效能最佳。
　　2.4.胃癌診斷模型的建立
　　應用二分類 Logistic回歸分析建立胃癌的診斷模型。miR-17-5p和miR-127-3

16、p是胃癌患病的危險因素。胃癌的診斷公式為：Y=110.98 EmiR-17-5p+66.5EmiR-127-3p-2.73其中EmiR-17-5p是miR-17-5p在患者血漿中的表達量（2-ΔCt值），EmiR-127-3p是miR-127-3p在患者血漿中的表達量。以Y=0.55為診斷點，診斷模型在區(qū)分胃癌患者和健康受試者的敏感度為67.10%，特異度可達96.30%，診斷的曲線下面積為0.84(95%CI:0.78-0.90)，與

17、單一指標相比，診斷效能有所提高。
　　結論：
　　1.在胃癌FFPE樣本及血漿樣本中，miRNAs種類少，表達量高。
　　2.血漿中的miR-17-5p，miR-127-3p，miR-379-5p，miR-433-3p，miR-654-3p可能源于胃癌細胞的直接分泌，并在胃癌早期明顯升高。
　　3.血漿中miR-17-5p和miR-127-3p是胃癌患病的危險因素。胃癌的診斷公式為：Y=110.98EmiR-17

18、-5p+66.5EmiR-127-3p-2.73，Y大于0.55時認為受試者存在胃癌。
　　第二部分：胃癌細胞來源的miR-17-5p抑制樹突狀細胞成熟
　　目的：
　　探究胃癌細胞來源的miR-17-5p對DCs成熟的影響。
　　方法：
　　應用qRT-PCR技術檢測胃癌細胞培養(yǎng)基中miR-17-5p的表達水平，觀察其分泌情況。用cy3標記hsa-miR-17-5p mimics，收集胃癌細胞的條件培養(yǎng)基

19、與DCs共培養(yǎng)，用流式細胞術及共聚焦顯微鏡觀察DCs對hsa-miR-17-5p mimics的攝取。分離小鼠脾臟DCs，經磁珠提純，應用流式細胞術檢測DCs的表型及FITC-葡聚糖吞噬率；qRT-PCR及ELISA檢測各組DCs中細胞因子的表達水平。DCs經絲裂霉素C處理后與CD4+T細胞共培養(yǎng)，應用BrdU摻入實驗檢測CD4+T的增殖能力，流式細胞術檢測共培養(yǎng)體系中Treg(CD4+CD25+Foxp3+)的比例。
　　結果：

20、
　　1.人胃癌細胞可分泌miRNA-17-5p
　　應用qRT-PCR技術檢測人胃癌細胞系BGC-823細胞及培養(yǎng)基中該小RNA的表達水平，結果顯示，以低濃度種植的細胞，其培養(yǎng)基中miR-17-5p的相對表達量呈時間依賴性，以中濃度種植的細胞，其培養(yǎng)基中miR-17-5p的表達量時間依賴性不明顯；以高濃度種植的細胞，miR-17-5p在換液24 h后表達明顯增多，而在換液48 h后表達量較前下降。在換液24 h后，培養(yǎng)基中

21、miR-17-5p的表達量與細胞數呈正相關。以上數據提示胃癌細胞可以分泌miR-17-5p至細胞外，且在一定數量內呈時間依賴性分泌，細胞過密影響miR-17-5p的分泌。
　　2.人未成熟DCs可以攝取人胃癌細胞釋放的miRNAs-17-5p
　　用cy3標記hsa-miR-17-5p轉染胃癌細胞，收集其條件培養(yǎng)基與人未成熟DCs(immuture dendritic cell,imDCs)進行共培養(yǎng)，應用流式細胞術檢測im

22、DCs中cy3陽性細胞的百分比。結果顯示，與不處理、只加入轉染試劑和轉染普通hsa-miR-17-5p的胃癌細胞條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)的imDCs中只檢測到微弱的cy3熒光信號，而與轉染cy3標記hsa-miR-17-5p的胃癌細胞條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)的imDCs中，cy3陽性細胞百分比顯著升高。進一步應用共聚焦顯微鏡觀察各組imDCs中的cy3信號，結果顯示，只在與轉染cy3標記hsa-miR-17-5p的胃癌細胞條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)的imDCs中

23、見到微弱的紅色cy3信號，其余3組均未見cy3信號。提示人imDCs可以攝取人胃癌細胞分泌的miR-17-5p。
　　3.miR-17-5p抑制LPS誘導的imDCs成熟
　　3.1.miR-17-5p抑制LPS誘導的DCs成熟標志物表達
　　對小鼠來源的DCs進行分離、鑒定及免疫磁珠分選，流式細胞術鑒定其純度。CD11c+細胞的百分比可達95%以上。
　　imDCs經LPS刺激后，細胞表面DCs成熟標志CD80

24、、CD86、MHC-II的表達水平均顯著升高。預先轉染mmu-miR-17-5p mimics的imDCs在LPS刺激后細胞表面CD80、CD86、MHC-II的表達水平并沒有明顯變化，顯著低于轉染scramble control的imDCs。提示miR-17-5p抑制LPS誘導的小鼠DCs成熟標志物表達。
　　3.2.miR-17-5p可對抗LPS依賴的抗原吞噬抑制
　　imDCs在成熟過程中，吞噬功能逐漸下降，用FITC

25、標記的葡聚糖內吞實驗檢驗其吞噬功能。結果顯示，imDCs經LPS刺激后，吞噬功能顯著下降，轉染mmu-miR-17-5p mimics的imDCs在LPS刺激后其抗原吞噬功能顯著高于轉染scramble control的imDCs，但仍顯著低于imDCs。提示 miR-17-5p可對抗 LPS誘導的抗原吞噬抑制，但尚不能恢復到刺激前的水平。
　　3.3.miR-17-5p調節(jié)LPS誘導的DCs細胞因子分泌譜
　　應用qRT-

26、PCR及ELISA分別檢測IL-12、TNF-α、IL-10在mRNA及蛋白水平的表達情況。結果顯示，imDCs產生低水平的IL-12、TNF-α，和較高水平的IL-10，LPS刺激后，IL-12、TNF-α表達水平顯著升高，IL-10表達水平顯著降低；預先轉染mmu-miR-17-5p的imDCs，在LPS刺激后，與轉染scramble control的imDCs相比，TNF-α和IL-12表達水平顯著降低，IL-10的表達水平顯著升

27、高。提示miR-17-5p促進免疫抑制因子的合成和釋放，而抑制抗腫瘤免疫因子的合成和釋放。
　　4.轉染miR-17-5p的DCs對T細胞的調節(jié)作用
　　4.1.轉染miR-17-5p的DCs抑制CD4+T細胞的增殖
　　免疫磁珠提純T細胞。流式細胞術結果顯示，分選后，CD4+T細胞的百分比均達95%以上。
　　DCs經絲裂霉素 C處理后與同種異體的CD4+ T細胞共培養(yǎng)，應用BrdU摻入實驗檢測CD4+T的增值

28、能力。結果顯示，imDCs經LPS刺激后，刺激CD4+T細胞增殖的能力顯著性提高；而轉染mmu-miR-17-5p的DCs(DCs-miR-17)經LPS刺激后再與T細胞共培養(yǎng)時，與轉染scramble control的imDCs相比，刺激T細胞增殖的能力明顯減弱。以低DCs比例（1:20,1:50,1:100）與T細胞共培養(yǎng)時，DCs-miR-17刺激T細胞增殖的能力與imDCs類似，而以高DCs比例（1:10）共培養(yǎng)時，DCs-mi

29、R-17刺激T細胞的能力較imDCs顯著性降低。提示miR17-5p降低了DCs刺激CD4+T細胞增殖的能力。
　　4.2.轉染miR-17-5p的DCs促進Treg的擴增
　　應用流式細胞術檢測共培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。結果顯示，與mDCs相比，與imDCs共培養(yǎng)的T細胞中，Treg比例明顯增多，而DCs-miR-17誘導的Treg顯著多于轉染scramble control的imDCs誘導

30、的Treg，甚至高于未轉染的imDCs。以上數據表明miR17-5p處理的DCs促進CD4+CD25+Foxp3+Treg的擴增。
　　結論：
　　1.miR-17-5p由胃癌細胞分泌，被DCs攝取。
　　2.miR-17-5p抑制LPS誘導的DCs成熟。
　　3.胃癌微環(huán)境中，miR-17-5p通過抑制DC成熟，抑制CD4+T細胞增殖，促進Treg擴增。
　　第三部分：miR-17-5p靶基因的篩選及驗證

31、
　　目的：
　　篩選miR-17-5p對抗LPS誘導的DCs成熟的靶蛋白，闡明其抑制腫瘤免疫的機制。
　　方法：
　　在miRTarBase數據庫檢索已驗證的miR-17-5p靶基因，進行GO富集分析及KEGG通路分析，找到參與免疫系統(tǒng)發(fā)育的基因集，將基因集映射到STRING中構建基因編碼的蛋白之間相互作用關系網，篩選結合分數大于0.7的相互作用關系對，導入Cytoscape計算各個節(jié)點的拓撲特性，篩選核心基因

32、。應用qRT-PCR驗證miR-17-5p對靶基因的調控。用western blot驗證miR-17-5p靶基因的功能。
　　結果：
　　1.miR-17-5p靶基因的富集分析
　　在miRTarBase上檢索已驗證的靶基因進行整理。結果顯示，已驗證過的miR-17-5p靶基因共有1142個，其中經報告基因實驗驗證過的靶基因共63個，這些靶基因均是miR-17-5p的直接作用靶點。對63個靶基因進行GO富集分析和通路富

33、集分析。結果顯示，這些基因在免疫學過程(immune system process,42.86%)和發(fā)育過程(developmental process,63.49%)中存在顯著的富集。KEGG通路富集結果顯示，這些基因主要在腫瘤通路(pathways in cancer,28.57%)及miRNAs相關的腫瘤通路(miRNAs in cancer,22.22%)中富集。
　　2.免疫系統(tǒng)發(fā)育過程相關的miR-17-5p靶基因篩選

34、
　　本研究重點關注同時參與了免疫學過程和發(fā)育過程的23個基因。將數據導入STRING進行分析，去除孤立及渙散鏈接的基因，結果顯示，共有22個基因的編碼蛋白存在相互間作用，形成相互作用網絡圖。挑選結合分數大于0.7的關系對，將其對應數據導入Cytoscape計算網絡節(jié)點的拓撲特性。結果顯示，該網絡由19個節(jié)點和70條邊組成，最大度值（degree）為8，最小度值為1，平均3.68±2.31。本研究認為在網絡中起主要作用的核心基因（

35、hub genes）為度數≥mean＋1 SD的蛋白所對應的基因，即PTEN,BCL2,CDKN1A,HIF1A及VEGFA。
　　3.胃癌免疫相關的miR-17-5p靶基因的進一步篩選
　　KEGG通路分析顯示參與免疫系統(tǒng)發(fā)育過程的5個核心基因均參與了腫瘤通路，進一步在KEGG DISEASE在線數據庫中進行檢索，發(fā)現BCL2和VEGFA與胃癌相關，提示這兩個基因有可能通過調控免疫系統(tǒng)的功能影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。
　　

36、4.miR-17-5p抑制imDCs中BCL2的轉錄
　　向imDCs轉染mmu-miR-17-5p mimics，或scramble control。應用qRT-PCR技術檢測BCL2和VEGFA的表達。結果顯示，與轉染scramble control的imDCs相比，轉染miR-17-5p mimics的imDCs中BCL2表達顯著下降。VEGFA的表達量在轉染miR-17-5p mimics及轉染scramble contr

37、ol的imDCs間沒有差異。結果提示，miR-17-5p抑制imDCs中BCL2的轉錄。
　　5.miR-17-5p促進imDCs的凋亡
　　既往研究表明，imDCs吞噬凋亡細胞中的自身抗原，維持自身的未成熟狀態(tài)，介導對自身抗原的免疫耐受。而吞噬了凋亡DCs的imDCs，對LPS誘導的成熟不再敏感。本研究應用western技術檢測DCs中凋亡相關蛋白的表達。結果顯示，與轉染scramble control的DCs相比，預先轉

38、染mmu-miR-17-5p mimics的DCs中Bcl-2蛋白表達顯著下降，促凋亡蛋白Bax以及cleaved caspase-3的表達升高。提示miR-17-5p促進DCs的凋亡。上部分結果證明，miR-17-5p mimics增強了DCs的抗原吞噬功能，因此我們推斷miR-17-5p轉染后，存活DCs通過吞噬凋亡DCs，抑制LPS誘導的成熟。
　　結論：
　　1.PTEN,BCL2,CDKN1A,HIF1A及VEGF