非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)評(píng)價(jià)標(biāo)志物的篩選.pdf

1、背景:肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率在國內(nèi)和國際上已位居各種惡性腫瘤的首位。其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的80％。造成肺癌死亡率居高不下的最主要的原因是缺少準(zhǔn)確的早期診斷及有效的治療效果監(jiān)測(cè)手段。由于肺癌早期沒有明顯癥狀,80%以上的肺癌患者到醫(yī)院就診時(shí)已屬晚期,失去了外科手術(shù)和多學(xué)科根治治療的最佳時(shí)機(jī)。加之肺癌的預(yù)后較差,總體5年生存率只有10-15%。即便是I期的非小細(xì)胞肺癌(Non Small Cell Lung Canc

2、er,NSCLC),手術(shù)治療后仍有約30%的患者死于腫瘤復(fù)發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移。自身免疫抗體是機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)以基因結(jié)構(gòu)和功能異常為實(shí)質(zhì)的一系列病理變化所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答產(chǎn)物。作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物,自身免疫抗體在血液中表達(dá)水平的變化能夠直接或間接反映病理狀況的改變,也是導(dǎo)致具有相同組織病理類型和分期的腫瘤患者表現(xiàn)不同預(yù)后,或不同治療反應(yīng)原因之一。本實(shí)驗(yàn)擬將噬菌體展示技術(shù)與蛋白質(zhì)芯片技術(shù)相結(jié)合,利用篩大量已存的NSCLC患者血清及隨訪結(jié)果選出

3、新型NSCLC高敏感性和特異性的血清自身免疫抗體作為分子標(biāo)志物用于NSCLC的預(yù)后評(píng)價(jià)。
　　方法:1.提取5份非小細(xì)胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer,NSCLC)術(shù)后腫瘤組織總RNA,純化mRNA并構(gòu)建T7噬菌體cDNA文庫。2.利用NSCLC預(yù)后良好和不良患者血清對(duì)T7文庫進(jìn)行生物淘洗,挑選出1268個(gè)腫瘤特異性的T7單克隆構(gòu)建蛋白芯片。3.構(gòu)建蛋白芯片,并分別用23分預(yù)后良好患者血清和34分預(yù)后不

4、良血清孵育芯片并進(jìn)行 Cy5/Cy3雙熒光標(biāo)記。4.分析掃描芯片所得數(shù)據(jù),篩選出能夠區(qū)分預(yù)后良好和不良血清的診斷標(biāo)志物組合并進(jìn)行留一法驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。5.對(duì)腫瘤特異性的T7插入序列進(jìn)行PCR測(cè)序,Blast所得DNA序列并進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:1.成功構(gòu)建非小細(xì)胞T7噬菌體cDNA文庫,滴度檢測(cè)表明原始文庫滴度為3.7×106pfu/mL。隨機(jī)挑取96個(gè)噬菌斑進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果表明文庫的重組率為95%,符合質(zhì)量要求。2.文庫經(jīng)擴(kuò)增

5、,滴度檢測(cè)為7×1010 pfu/mL。隨機(jī)挑取96個(gè)噬菌斑進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果表明文庫重組率為95%,97.9%克隆(插入片段)大于250bp,10.5%克隆大于750bp。生物淘洗后隨機(jī)挑選96個(gè)克隆進(jìn)行 PCR,結(jié)果表明淘洗后文庫重組率為98%,92.9%克隆大于250bp,18.4%克隆大于750bp。淘洗后重組率明顯提高,并且含有大片段的克隆得到明顯富集。3.構(gòu)建的蛋白芯片經(jīng)Cy5、Cy3雙熒光檢測(cè)系統(tǒng)及統(tǒng)計(jì)學(xué)篩選分析芯片后,

6、得到最佳評(píng)價(jià)組合含6個(gè)NSCLC預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物,其聯(lián)合診斷準(zhǔn)確率達(dá)到80.7%,敏感性為85.3%,特異性為73.9%,AUC為0.825。測(cè)序及Blast分析表明其中3個(gè)標(biāo)志物是已知癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)分子,分別是 abl-interactor1(ABI1),pleiotrophin(PTN)和surfactant protein B(SFTPB)。另外3個(gè)標(biāo)志物都是人基因組中未研究過的基因。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌T7