大腸桿菌I型群體感應功能研究.pdf

1、大腸桿菌I 型群體感應功能研究F u n c t i o n o f Q u o r u m S e n s i n g - - Ii n v o l v e di n博士生：羊揚導師：朱國強專業(yè)：預防獸醫(yī)學揚州大學2 0 1 4 年6 月揚州大學博士學位論文供A I ．1 的菌株源，阻礙了病原性大腸桿菌I 型群體感應系統(tǒng)功能的深入探討，并引發(fā)腸道環(huán)境中是否存在激活大腸桿菌I 型群體感應系統(tǒng)的外源A 甩的質疑。事實上，之前研究人員通過多

2、種手段進行篩選，均沒有成功先例。在牛瘤胃中，雖然分泌合成這些特定A H L信號分子的特定細菌同樣一直沒有成功分離，然而多種Q S ．I 型系統(tǒng)信號分子酰基高絲氨酸內酯( A H L ) 卻在牛瘤胃中存在，成功分離，并對其功能進行檢測；這些A H L 信號分子被認為在牛消化道內參與調節(jié)食源性病原菌基因表達和調控，在病原菌通過胃腸消化道及消化道內生存定殖進程中發(fā)揮重要作用。其中，A H L 信號對病原大腸桿菌0 1 5 7 “ } 1 7

3、致病過程的調節(jié)尤為引起研究人員關注，顯得尤為重要。鑒于上述研究積累和A H L 陽性菌必然存在的理論推測，我們在牛瘤胃菌平臺上進行研究，設計出一種改進的A H L 陽性菌分離方案，在牛瘤胃和豬腸道內成功篩選出A 甩陽性菌，并就A H L 產生的特征、功能和病原大腸桿菌互作進行了深入探析。富集、蒸發(fā)和濃縮等重要步驟增加在改進的篩選流程中，由牛瘤胃液中成功分離了一株銅綠假單胞菌，命名為Y Z l ，并對其合成A H L 的能力進行鑒定。基于

4、J Z A l 報告茵中含有腸記報告基因，在A H L 存在環(huán)境中能夠激活半乳糖苷酶活性的特性，其探測范圍和對～．1 敏感度較高，我們選定該報告菌定量檢測Y Z l 產A H L能力，發(fā)現在6 h 時合成能力達到最高峰：1 6 s r D N A 法被運用于對Y Z l 菌的鑒定，確認其為銅綠假單胞菌；考慮到僅利用J Z A l 檢測而可能產生的假陽性結果，利用C V 0 2 6 報告菌在感知到外源A H L 的環(huán)境中激活紫色色素合成的

5、特性，進一步確認其A H L 合成能力；隨后利用p S B 4 0 1 、p S B l l 4 2 兩株報告菌分別用于感知短鏈、長鏈A H L 并對Y Z l 合成A H L的種類進行檢驗；利用液質聯譜，在Y Z l 培養(yǎng)上清中鑒定出至少三種不同的A H L 分子，包括C 4 ．H S L 、C 8 ．H S L 、3 - o x o ．C 1 2 ．H S L 。將銅綠假單胞菌Y Z l 株中短鏈和長鏈A H L 的合成基因l a

6、s I 及r h l l 分別克隆入0 1 5 7 ：H 7 大腸桿菌，成功賦予其自身合成A H L 的能力，并進一步證明銅綠假單胞茵合成的A H L 能調控大腸桿菌相應基因表達，激活S d i A 受體蛋白表達上調約1 ．7 倍：泳動實驗和耐酸性實驗表明，銅綠假單胞菌合成的A H L 調控大腸桿菌的生理代謝，受調控重組大腸桿菌運動性下降2 5 ％，耐酸性提高約4 倍，且上述表型變化與鞭毛F I i C 編碼基因的4 倍下調、g a d