RNA干擾沉默TREM-1對脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一章TREM-1在脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應(yīng)中的表達(dá)。 目的:探討在脆弱類桿菌脂多糖所誘導(dǎo)THP-1與HL-60細(xì)胞炎癥反應(yīng)中TREM-1的表達(dá)情況及其與促炎癥因子分泌的關(guān)系。 方法:厭氧分離培養(yǎng)脆弱類桿菌臨床株，改良熱酚水法提取細(xì)菌脂多糖，以脆弱類桿菌脂多糖刺激分化后的單核細(xì)胞株THP-1和粒細(xì)胞株HL-60，半定量RT-PCR法檢測TREM-1 mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測TREM-1蛋白的表達(dá)，并

2、用ELISA法檢測THP-1細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β與HL-60細(xì)胞上清中IL-6、IL-8的含量。 結(jié)果:在脆弱類桿菌脂多糖刺激下，分化后的THP-1 與 HL-60細(xì)胞中TREM-1表達(dá)水平皆明顯上調(diào)，并呈時(shí)間依賴性，分別于8h(THP-1)和 12h(HL-60)達(dá)高峰；而不同濃度的脆弱類桿菌脂多糖對TREM-1的誘導(dǎo)作用呈劑量依賴性，以1μg/ml 脂多糖的誘導(dǎo)效應(yīng)最明顯；同時(shí)伴有 TNF-α、IL-1β(THP

3、-1)及IL-6、IL-8(HL-60)的大量分泌，并分別與TREM-1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r<,s>=0.82，0.85及0.83,0.88，P<0.01)。 結(jié)論: TREM-1 表達(dá)水平在脆弱類桿菌脂多糖的誘導(dǎo)下呈時(shí)間一劑量依賴性增高，并可能對促炎癥因子的分泌起一定作用。構(gòu)建的脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型為后續(xù)研究提供了實(shí)驗(yàn)平臺。 第二章 TREM-1靶向性shRNA對脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應(yīng)的抑制作用。

4、 目的:研究通過RNA干擾技術(shù)使TREM-1基因沉默后對脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應(yīng)的影響。 方法:體外轉(zhuǎn)錄法合成針對TREM-1 mRNA的shRNA，電穿孔法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入分化后的THP-1 與HL-60細(xì)胞，繼予1μg/ml脆弱類桿菌脂多糖分別刺激8h與12h，于轉(zhuǎn)染后48h通過半定量RT-PCR法檢測 TREM-1 mRNA 的表達(dá)，Western blot法檢測 TREM-1 蛋白的表達(dá)，并用ELISA法檢測THP-1 細(xì)

5、胞上清中促炎癥因子 TNF-α、IL-1β與HL-60細(xì)胞上清中促炎癥因子IL-6、IL-8含量的變化。 結(jié)果:轉(zhuǎn)染shRNA后TREM-1 mRNA及蛋白表達(dá)均有明顯下調(diào)，其中以shRNA-2干擾效果最為明顯。同時(shí)，轉(zhuǎn)染shRNA使THP-1細(xì)胞上清中TNF-α，IL-1β的含量與HL-60細(xì)胞上清中IL-6、IL-8的含量明顯降低。而對照組無類似效果。 結(jié)論:電轉(zhuǎn)染體外轉(zhuǎn)錄合成的shRNA可選擇性抑制YREM-1表達(dá)

6、，下調(diào)脆弱類桿菌脂多糖誘導(dǎo)的促炎癥因子的分泌，對炎癥反應(yīng)具有抑制作用。 第三章 RNA干擾沉默TREM-1對脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應(yīng)抑制作用的機(jī)制。 目的:探討RNA干擾沉默TREM-1對脆弱類桿菌脂多糖炎癥反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用的機(jī)制。 方法:電轉(zhuǎn)染TREM-1 shRNA-2或shRNA-NC入分化后的THP-1與HL-60細(xì)胞并予以脆弱類桿菌脂多糖刺激，Western blot法測定各組細(xì)胞中DAP12、NF-κ

7、B p65、IκBα蛋白表達(dá)水平，RT-PCR法檢測THP-1 細(xì)胞中 TNF-α、IL-1β mRNA及與HL-60細(xì)胞中IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果:TREM-1 shRNA-2 轉(zhuǎn)染能明顯下調(diào)脆弱類桿菌脂多糖作用下THP-1 與 HL-60細(xì)胞中DAP12、NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平和上調(diào)IκBα蛋白的表達(dá)水平，并降低 TNF-α、IL-1β及IL-6、IL-8 mRNA的表達(dá)水平，而shRNA-NC