RNA干擾沉默TREM-1對脆弱類桿菌膿毒癥炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：構(gòu)建髓系細(xì)胞觸發(fā)受體1（TREM-1）基因重組慢病毒RNA（vshRNA）載體，通過抑制TREM-1的表達(dá)，進(jìn)一步探討TREM-1對脆弱桿菌膿毒癥小鼠促炎因子表達(dá)及生存率的影響，以及TREM-1對NF-κB通路的相互影響。 方法：（1）以脆弱類桿菌對小鼠行腹腔注射造成脆弱桿菌膿毒癥小鼠模型。收集肝組織提取總RNA或總蛋白，半定量RT-PCR法檢測TREM-1 mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測TREM-1蛋白的

2、表達(dá)，并用ELISA法檢測血漿中TNF-α、IL-1β與IL-6的含量。 （2）根據(jù)小鼠TREM-1的mRNA序列選擇4個靶序列并設(shè)計合成4對雙鏈DNA oligo，同時合成1對陰性對照雙鏈DNA oligo；將以上5對雙鏈DNA oligo退火后連入pGCSIL-GFP載體，PCR和測序鑒定后，將以上質(zhì)粒分別和包裝質(zhì)?；旌衔锕厕D(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生病毒顆粒。各組病毒載體轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞后，實時定量PCR、ELISA

3、觀察干擾TREM-1后脆弱桿菌內(nèi)毒素引發(fā)的Raw264.7細(xì)胞內(nèi)毒素血癥模型中TREM-1的表達(dá)變化。 （3）建立脆弱桿菌小鼠膿毒癥模型并運用TREM-1 vshRNA進(jìn)行整體轉(zhuǎn)染，觀察TREM-1 vshRNA對TREM-1的抑制情況，并檢測相關(guān)炎癥因子在組織及血漿中的表達(dá)。將15只小鼠隨機(jī)按數(shù)字表法分為5組（每組3只），即正常對照組和陽性對照組、TREM-1干擾組、TREM-1半量干擾組、綠色熒光蛋白（GFP）干擾組。按組分

4、別經(jīng)尾靜脈注射等滲鹽水、TREM-1 vshRNA2×108 TU、TREM-1 vshRNA1×108 TU、GFP vshRNA；1 h后，后4組小鼠同前制成膿毒癥模型，正常對照組腹腔注射等體積等滲鹽水。12 h后處死5組小鼠（每組3只），檢測肝組織及血漿TNF-α、IL-1β和IL-6含量；取肝脾組織標(biāo)本檢測TREM-1mRNA及其蛋白的表達(dá)水平，以及肝內(nèi)IκBα、pDAP12和核內(nèi)NF-κBp65的蛋白表達(dá)情況的變化。

5、（4）對脆弱桿菌膿毒癥小鼠尾靜脈注射TREM-1 vshRNA后，觀察小鼠的存活率。將清潔級BALB/c雄性小鼠225只按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組。第1組100只小鼠又隨機(jī)分為陽性對照組、TREM-1干擾組、TREM-1半量干擾組、綠色熒光蛋白（GFP）干擾組，每組25只。第2組100只小鼠隨機(jī)分為4組（每組25只），分別于腹腔注射脆弱桿菌后1、2、4、6h尾靜脈注射TREM-1vshRNA2×108 TU。第3組25只小鼠行尾靜脈注射等滲

6、鹽水作為對照組。計算各組小鼠腹腔注射脆弱桿菌后72 h存活率。 結(jié)論：小鼠肝組織中TREM-1的表達(dá)水平在脆弱類桿菌的誘導(dǎo)下呈時間--劑量依賴性增高。成功構(gòu)建了小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒載體。證實所構(gòu)建的慢病毒載體能夠抑制脆弱類桿菌LPS所誘導(dǎo)的TREM-1的表達(dá)。運用尾靜脈注射小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒載體進(jìn)行TREM-1干擾可有效降低脆弱桿菌膿毒癥小鼠肝脾組織TREM-1表達(dá)水平，下調(diào)脆弱類桿菌誘導(dǎo)的促炎癥因