RNA干擾沉默TREM-2對內(nèi)毒素所致急性肺損傷小鼠肺泡巨噬細胞炎癥反應的影響.pdf

1、目的: 本研究擬通過RNAi技術，選擇TREM-2為靶點，構建編碼小鼠TREM-2基因的shRNA(short hairpin RNA)真核質(zhì)粒表達載體，從中篩選出能高效干擾TREM-2mRNA的siRNA序列；將其合成重組慢病毒載體感染小鼠肺泡巨噬細胞，觀察其對TREM-2基因mRNA和相應功能蛋白表達的抑制程度；探討在LPS所誘導小鼠肺泡巨噬細胞炎癥反應中TREM-2在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達規(guī)律以及與促炎癥因子分泌的關系；通過RNAi

2、技術使體外培養(yǎng)的小鼠肺泡巨噬細胞TREM-2基因沉默后予以LPS刺激，檢測TREM-2、TLR4和TREM-1受體的表達和促炎癥因子的分泌，觀察沉默TREM-2表達對LPS炎癥反應的影響；在體外研究的基礎上，通過氣管內(nèi)感染重組慢病毒載體后，再予以LPS刺激復制ALI動物模型，檢測肺組織中TLR4和TREM受體的表達情況，以及肺泡灌洗液炎癥因子的分泌水平，探索TREM-2在ALI治療中的應用前景，為闡明革蘭氏陰性桿菌感染的致病機理提供實驗

3、基礎，也為臨床防治這類感染提供新思路。 方法: 1.構建靶向小鼠TREM-2基因shRNA真核質(zhì)粒表達載體。 首先在GenBank上選取小鼠TREM-2mRNA序列，根據(jù)siRNA設計原則，設計合成TREM-2-shRNA及無任何干擾效果的陰性shRNA的DNA模板單鏈，并進行BLAST驗證。在兩端加入限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII的酶切位點，退火形成雙鏈。質(zhì)粒pGCsi的BamHI+HindIII雙酶切

4、線性化，稀釋退火片段與線性化pGCsi質(zhì)粒表達載體經(jīng)T4DNA連接酶連接，經(jīng)過PCR鑒定和DNA測序。構建的三個重組質(zhì)粒分別命名為pTREM-2-shRNA1、pTREM-2-shRNA2和pNeg—shRNA(陰性對照)。 2.質(zhì)粒pTREM-2-shRNA轉(zhuǎn)染小鼠肺泡巨噬細胞篩選干擾TREM-2的最佳siRNA序列。 ①體外原代培養(yǎng)小鼠AM：采用支氣管肺泡灌洗法從C57BL/6小鼠肺內(nèi)分離AM，并用貼壁法純化，在含有

5、10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中原代培養(yǎng)AM。倒置相差顯微鏡觀察AM的形態(tài)和生長特性，并進行AM特異性表型CD68表達的檢測鑒定。 ②將不同比例的質(zhì)粒pTREM-2-shRNA和轉(zhuǎn)染試劑TransFectin Lipid的復合物，以不同時間轉(zhuǎn)染小鼠AM，因質(zhì)粒中含有綠色熒光蛋白(GFP)的報告基因，轉(zhuǎn)染后48小時可用熒光顯微鏡觀察熒光表達，并用流式細胞儀FITC的常規(guī)檢測方法檢測轉(zhuǎn)染效率，同時用MTT法檢測細胞存活率。根

6、據(jù)轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，用最佳配比的質(zhì)粒pTREM-2-shRNA和轉(zhuǎn)染試劑復合物轉(zhuǎn)染AM，分別于轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后48h，采用實時熒光定量RT-PCR檢測TREM-2mRNA表達水平，同時設立未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒組(pCon)、陰性質(zhì)粒組(pNeg—shRNA)作為對照。 3.構建靶向抑制小鼠TREM-2基因的shRNA重組慢病毒載體。 利用Lenti慢病毒包裝系統(tǒng)，自構建的pTREM-2-shRNA真核質(zhì)粒表達載體中酶切出目

7、的基因片段，與慢病毒穿梭質(zhì)粒pLenti—EGFP—U6相連接，慢病毒包裝必需的3個蛋白LP1、LP2、VSV—G分別獨立放置在3個質(zhì)粒上(pLP1、pLP2、pVSV—G)。四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞中，包裝成重組的慢病毒載體Lenti—EGFP—TREM-2-shRNA并擴增、純化、鑒定。構建的兩個重組慢病毒分別命名為Lenti—EGFP—TREM-2-shRNA和Lenti—Neg—shRNA(陰性對照)。 4.慢病毒介導

8、的TREM-2-shRNA干擾體外培養(yǎng)小鼠肺泡巨噬細胞TREM-2表達的研究。 應用已構建好的Lenti—EGFP—TREM-2-shRNA真核表達載體感染小鼠AM，對感染復數(shù)(MOI)、不同配比的慢病毒—感染試劑復合物、感染時間等感染條件進行優(yōu)化的前提下，用最佳感染條件感染小鼠AM，分別于感染前及感染后72h，采用熒光定量RT-PCR和流式細胞儀檢測TREM-2mRNA及蛋白表達水平的變化。同時設立未感染組、空白對照組(Len

9、ti—EGFP)、陰性對照組(Lenti—Neg—shRNA)作為對照。 5.小鼠肺泡巨噬細胞TREM-2在內(nèi)毒素炎癥反應中的表達。 以不同濃度(10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml)LPS分別刺激小鼠肺泡巨噬細胞0h、3h、6h、12h、24h，至預定時間后收集細胞，熒光定量PCR、流式細胞儀等方法檢測在LPS誘導的炎癥反應過程中TREM-2基因在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達，同時通過ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上

10、清液中促炎癥因子的含量。 6.慢病毒介導的TREM-2-shRNA對小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)毒素炎癥反應的影響。 采用已構建好的Lenti—EGFP—TREM-2-shRNA，選擇最佳感染條件將其導入小鼠AM中，于感染后72h再給予100ng/mlLPS刺激3h，收集細胞。通過熒光定量PCR、流式細胞儀等方法檢測在LPS誘導的炎癥反應過程中TREM-2、TLR4和TREM-1基因在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達，同時通過ELISA法檢測

11、細胞培養(yǎng)上清液中促炎癥因子TNF-α和IL-10含量的變化。同時設立未感染組、LPS組、空白對照+LPS組(感染Lenti—EGFP后給予LPS)、陰性對照+LPS組(感染Lenti—Neg—shRNA后給予LPS)作為對照。 7.慢病毒介導的TREM-2-shRNA對內(nèi)毒素所致急性肺損傷小鼠炎癥反應的影響。 健康雄性C57BL/6小鼠用2％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉后通過氣管滴注的方法感染已構建好的Len

12、ti—EGFP—TREM-2-shRNA(1×108TU/animal)，感染后待蘇醒，繼續(xù)飼養(yǎng)。7d后，麻醉下氣管內(nèi)滴注內(nèi)毒素(2.5mg/kg溶于50μl無菌鹽水中)，建立ALI小鼠模型，24h后結束實驗。分別進行以下檢測：1)留取各組小鼠肺組織標本制成切片，HE染色后用普通光學顯微鏡觀察。2)通過免疫組化和免疫熒光方法觀察在LPS誘導的炎癥反應過程中肺組織TREM-2、TLR4和TREM-1的表達情況。3)通過熒光定量PCR、We

13、stern—Blot等方法檢測肺組織TREM-2、TLR4和TREM-1基因在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達。4)運用ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液中(BALF)下游炎癥因子TNF-α和IL-10蛋白的表達水平。同時設立未感染組、生理鹽水對照組(氣管內(nèi)滴注無菌生理鹽水)、ALI組(氣管內(nèi)滴注LPS)、空白對照+ALI組(氣管內(nèi)滴注Lenti—EGFP后給予LPS)、陰性對照+ALI組(氣管內(nèi)滴注Lenti—Neg—shRNA后給予LPS)作為對

14、照。 結論： 1.成功構建了以小鼠TREM-2基因為靶位的真核質(zhì)粒表達載體pTREM-2-shRNA。 2.通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件并聯(lián)合使用轉(zhuǎn)染試劑安全、有效地對小鼠AM進行基因轉(zhuǎn)染，TREM-2靶向性shRNA轉(zhuǎn)染可以有效降低TREM-2表達水平，且干擾效果具有序列特異性，其中以shRNA-1最明顯。 3.成功構建了攜帶TREM-2-shRNA的重組慢病毒載體。 4.應用RNAi技術，通過特異性的sh

15、RNA重組慢病毒載體在小鼠AM中實現(xiàn)對靶基因mRNA的降解，進而抑制相應功能蛋白的表達。 5.選擇以100ng/mlLPS刺激3h作為檢測時間點，為后續(xù)研究構建了實驗平臺。 6.體外實驗證明TREM-2靶向性shRNA轉(zhuǎn)染有效沉默了LPS刺激下TREM-2的表達，同時提高了TLR4受體的表達水平，促進TNF-α和IL-10的分泌，加強了TLR4介導的LPS信號轉(zhuǎn)導效能。從反面證實TREM-2具有負向調(diào)節(jié)炎癥的作用，在TL