RIP2小干擾RNA表達質粒對小鼠巨噬細胞及內毒素血癥的影響.pdf

1、背景和目的： 盡管廣譜抗菌素廣泛應用，細菌感染仍是住院病人死亡的主要原因。細菌及其產物會激活單核巨噬細胞系統(tǒng)釋放大量炎癥介質，引起內毒素血癥和多臟器功能衰竭。阻斷這些炎癥介質的生物學效應可降低感染急性期死亡率。目前發(fā)現(xiàn)機體通過細胞表面的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)和細胞內的NODs受體識別病原體相關分子模式 (pathogen-associated molecular patteros，PA

2、MPs)，引起免疫炎癥反應。RIP2是信號轉導途徑中關鍵的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是TLRs及NODs信號通路的下游因子，RIP2缺陷的巨噬細胞予LPS刺激后NF-κB激活下降，炎癥細胞因子如TNF-α等產生明顯減少，RIP2缺陷的小鼠能抵御內毒素的致死效應；而NODs通過募集RIP2激活NF-κB，RIP2顯性失活可抑制巨噬細胞NOD1介導的NF-κB激活。故RIP2在介導TLRs和NODs的信號級聯(lián)反應中起重要作用，引起宿主的天然和獲得

3、性免疫反應，激活NF-κB并產生炎癥細胞因子。本課題應用RNA干擾技術阻斷巨噬細胞RIP2的表達，研究其對巨噬細胞產生細胞因子的影響及其對小鼠內毒素血癥的保護效應。 方法：應用重組DNA技術和pRNAT-U6.1載體構建小鼠RIP2的siRNA真核表達質粒并測序。轉染巨噬細胞株RAW264.7后用RT-PCR和 Western blot方法檢測細胞RIP2的mRNA和蛋白表達，MTT 法測定細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡率；不

4、同濃度LPS刺激不同時間后，用ELISA法測定細胞 INF-α，半定量Western測定HMGB1的水平。RIP2 siRNA表達質粒經小鼠尾靜脈注射后，予LPS腹腔注射刺激小鼠，觀察小鼠死亡率，用RT-PCR方法檢測肝組織RIP2mRNA表達，Western blot方法檢測肝組織RIP2和HMGB1的蛋白表達，ELISA法測定血清 TNF-α的水平。 結果： 1、構建的RIP2 siRNA表達質粒的序列與我們設計的一

5、致。 2、RIP2 siRNA質粒轉染后，細胞內出現(xiàn)綠色熒光，證實質粒已成功轉入細胞。 3、Ⅲ號質粒轉染組細胞RIP2mRNA和蛋白表達減少，細胞增殖較空白質粒、Ⅰ號質粒和Ⅱ號質粒轉染組明顯增加而細胞凋亡減少；予LPS刺激后Ⅲ號質粒轉染組的TNF-αHMGBl濃度較其它組減少。 4、RIP2表達質粒體內轉染后，Ⅲ號質粒轉染組內毒素血癥小鼠的生存率較其它組高，而肝組織RIP2mRNA和蛋白表達較低，HMGB1蛋白表