不同來源大腸桿菌中喹諾酮外排泵基因oqxAB和qepA的傳播機(jī)制研究.pdf

1、氟喹諾酮類藥物是臨床和畜牧養(yǎng)殖上極其重要的抗菌藥物之一，廣泛應(yīng)用于臨床治療和動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐。近年來，隨著質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因（plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR）的出現(xiàn)，喹諾酮耐藥問題日趨嚴(yán)重。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮外排泵基因oqxAB和qepA在動(dòng)物源或人源菌株中已有較多的報(bào)道，在不同來源（動(dòng)物、食品和人）大腸桿菌中的傳播機(jī)制和攜帶oqxAB和qepA的耐藥質(zhì)粒特征尚不明確。本研究以不

2、同來源（動(dòng)物源、食品源、寵物源以及醫(yī)院臨床）的大腸桿菌為研究對(duì)象，分析PMQR基因（主要是oqxAB和qepA）的流行情況；闡明不同來源大腸桿菌中oqxAB和qepA的傳播規(guī)律和傳播機(jī)制；分析攜帶oqxAB和qepA基因多重耐藥質(zhì)粒的特征；為喹諾酮類藥物耐藥性防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為指導(dǎo)臨床合理用藥以及新藥研發(fā)提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。
　　采用瓊脂稀釋法測(cè)試1740株不同來源大腸桿菌對(duì)8類抗菌藥的敏感性，結(jié)果顯示，不同來源的大腸桿菌對(duì)磺胺

3、甲噁唑/甲氧芐啶耐藥率最高（80％）；其次是對(duì)氨芐西林（73%）、四環(huán)素（73%）、鏈霉素（67%）、喹乙醇（64%）；隨后是頭孢噻肟、頭孢他啶、新霉素、慶大霉素、安普霉素、氯霉素、氟苯尼考和環(huán)丙沙星，耐藥率在25%～53%之間；但頭孢西丁（7%）、阿米卡星（4%）和粘菌素（11%）耐藥率則較低。無論是動(dòng)物源、食品源還是醫(yī)院臨床大腸桿菌對(duì)氨芐西林、四環(huán)素的耐藥率均較嚴(yán)重，達(dá)55%以上。動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)鏈霉素、新霉素、安普霉素、氯霉素、氟

4、苯尼考、黏菌素和喹乙醇的耐藥率均高于食品源、寵物源和人源菌株；但對(duì)頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢他啶的耐藥率均低于人源菌株。值得注意的是豬、雞源大腸桿菌對(duì)喹乙醇的耐藥率達(dá)95%以上，遠(yuǎn)超于食品源（39%）和人源（38%）。食品源、人源和豬源大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率較低，分別為34%、29%、23%，但寵物源和雞源大腸桿菌卻達(dá)到50%以上。有趣的是，寵物源大腸桿菌對(duì)阿米卡星的耐藥率（27%）最高，遠(yuǎn)高于動(dòng)物源、食品源和人源。對(duì)隨機(jī)挑取的103

5、4株不同來源大腸桿菌進(jìn)行PMQR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)oqxAB基因在食品動(dòng)物源和食品源大腸桿菌中的檢出率（22.9%、22.9%）明顯高于醫(yī)院臨床和寵物源大腸桿菌的檢出率（12.3%、12.0%）。qnrS基因在食品動(dòng)物源大腸桿菌中的檢出率最高（30.3%），其次是在食品源（21.9%），顯著高于醫(yī)院臨床和寵物源（7.86%、8.01%）。而qepA在醫(yī)院臨床（4.08%）和寵物源（6.0%）的檢出率則要高于食品源（1.41%）和食品動(dòng)物源（

6、0.07%）。qnrB的檢出率在不同來源的大腸桿菌中檢出率均較低：寵物源2.0%、食品動(dòng)物源1.76%、和食品源0.35%，人源大腸桿菌則未檢出。所有菌株中均未檢測(cè)到qnrA、qnrC和qnrD。
　　利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-field electrophoresis PFGE）對(duì)50株不同來源oqxAB陽性大腸桿菌進(jìn)行親緣性分析，結(jié)果成功將45株oqxAB陽性大腸桿菌分為32個(gè)型，大部分菌株不存在克隆關(guān)系，但在不同動(dòng)物

7、或人之間以及動(dòng)物、食品和人源菌間均存在oqxAB陽性大腸桿菌的克隆傳播現(xiàn)象。通過電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，共獲得21株oqxAB陽性轉(zhuǎn)化子，且均表現(xiàn)出多重耐藥，轉(zhuǎn)化子SNJ43-1除外。S1-PFGE和Southern雜交結(jié)果顯示，21株oqxAB轉(zhuǎn)化子中含有1～4個(gè)質(zhì)粒，大小為28～500 kb，除SNX19-2無雜交信號(hào)，4個(gè)雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子有兩個(gè)雜交信號(hào)外，其余16個(gè)轉(zhuǎn)化子中oqxAB均定位于單一質(zhì)粒上。21株oqxAB轉(zhuǎn)化子中有13株利用復(fù)制子分

8、型成功，其中1株為IncN型質(zhì)粒，3株為IncHI2型質(zhì)粒，9株為IncF型質(zhì)粒，包括5株多復(fù)制子融合質(zhì)粒。質(zhì)粒酶切結(jié)果顯示，7株分離自豬、雞或食品的oqxAB陽性質(zhì)粒屬于同一RFLP型（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性），另外2株分離自雞和病人的oqxAB陽性質(zhì)粒屬于同一譜型，表明相似質(zhì)粒在不同來源大腸桿菌間的水平傳播也是oqxAB基因流行的原因之一。采用反向PCR和PCR mapping相結(jié)合的方式對(duì)oqxAB陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行oqxAB基因側(cè)翼序

9、列分析，結(jié)果在19株轉(zhuǎn)化子中oqxAB基因側(cè)翼均為2個(gè)同向插入序列IS26，該結(jié)構(gòu)與已報(bào)道的人醫(yī)臨床來源或動(dòng)物源的大腸桿菌或沙門氏菌相應(yīng)片段序列高度相似，提示插入序列IS26對(duì)oqxAB基因在不同型質(zhì)粒間的整合和不同來源菌株間的傳播擴(kuò)散發(fā)揮了重要作用。利用接合實(shí)驗(yàn)成功獲得2株不同來源且同時(shí)攜帶qepA和rmtB基因的接合子，均表現(xiàn)出多重耐藥。2株接合子中qepA/rmtB均位于F2:A-:B-型質(zhì)粒，而質(zhì)粒酶切結(jié)果顯示，與課題組2008

10、年獲得的寵物源接合子3A11-16J攜帶的F2:A-:B-型qepA/rmtB陽性質(zhì)粒屬于同一RFLP型，提示F2:A-:B-型質(zhì)粒的水平傳播是qepA和rmtB在不同來源大腸桿菌間協(xié)同擴(kuò)散的主要原因。
　　通過PacBio測(cè)序分析比較oqxAB陽性質(zhì)粒pHNZY32的多重耐藥質(zhì)粒結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)pHNZY32屬于多復(fù)制子融合質(zhì)粒，包括IncFII、IncN和IncX型復(fù)制子，轉(zhuǎn)移區(qū)及其毗鄰的先導(dǎo)區(qū)與F33:A-:B-型質(zhì)粒高度相似

11、，攜帶pemKI、vagCD、hok-sok和srnBC四種質(zhì)粒沉溺系統(tǒng)。pHNZY32攜帶兩個(gè)耐藥區(qū)，分別含有耐藥基因aph(3’)-IIa、Δble、oqxAB、blaTEM-1、rmtB、fosA3和blaCTX-M-55、，以及floR、tetA、strA、strB和sul2。推斷該質(zhì)?？赡苁且訬1-F33:A-:B-質(zhì)粒pHNFP460-1的相似質(zhì)粒為骨架，整合了包括oqxAB基因和復(fù)制子在內(nèi)的IncX型質(zhì)粒片段，以及包括耐藥

12、基因floR、tetA、strA、strB和sul2在內(nèi)的20 Kb片段，經(jīng)過多步插入、重組作用進(jìn)化形成的。質(zhì)粒pHNZY32的IncX型復(fù)制子區(qū)域在來自動(dòng)物和人的15個(gè)oqxAB轉(zhuǎn)化子中檢出，推測(cè)IncX型質(zhì)?？赡芘coqxAB基因在不同來源細(xì)菌間的傳播有關(guān)。
　　通過鳥槍隨機(jī)打碎構(gòu)建文庫的方法進(jìn)行qepA陽性質(zhì)粒pHN3A11測(cè)序，經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)pHN3A11質(zhì)粒骨架和其他IncFII型F2:A-:B-質(zhì)粒高度相似，如中國(guó)的pHK

13、23a，pFOS-HK151325和pXZ質(zhì)粒以及加拿大的pC15-1a質(zhì)粒。質(zhì)粒pHN3A11序列中存在能提高質(zhì)粒在垂直傳播過程中的穩(wěn)定性能的編碼基因，包括質(zhì)粒沉溺系統(tǒng)（pemI/pemK，hok/mok/sok）和分配系統(tǒng)（parM、parB、和stbB）。pHN3A11質(zhì)粒的多重耐藥區(qū)包括rmtB，qepA，blaTEM-1和dfr基因，上下游插入著若干個(gè)完整或截?cái)嗟牟迦胄蛄泻娃D(zhuǎn)座子，如ΔIS1，ΔTn2，ΔintI1，ISCR3

14、3，IS26和Tn21。采用PCR和測(cè)序的方法研究pHN3A11類似質(zhì)粒的流行分布情況。發(fā)現(xiàn)pHN3A11類似質(zhì)粒已廣泛擴(kuò)散于中國(guó)的寵物源、食品動(dòng)物源以及養(yǎng)殖環(huán)境源大腸桿菌中。
　　綜上所述，oqxAB基因在我國(guó)不同來源（食品動(dòng)物、寵物、動(dòng)物性食品和醫(yī)院臨床）大腸桿菌中普遍流行。垂直傳播以及多重耐藥質(zhì)粒和插入序列IS26等可移動(dòng)元件介導(dǎo)的水平傳播共同介導(dǎo)oqxAB基因在動(dòng)物源、食品源和人源大腸桿菌間流行和傳播。而qepA則常與rm