大腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)的耐氟喹諾酮類藥物6個(gè)基因PCR檢測(cè)研究.pdf

1、本研究選擇2006-2008年從四川、河南、甘肅、福建和江西5個(gè)省區(qū)的規(guī)模化豬場(chǎng)、醫(yī)院及野生動(dòng)物園分離鑒定的共256株大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌株。采用K-B紙片法檢測(cè)大腸桿菌6種常見FQs（氟喹諾酮類藥物）：NA（奈啶酸）、CIP（環(huán)丙沙星）、OFX（氧氟沙星）、ENR（恩諾沙星）、NOR（諾氟沙星）及LEV（左旋氧氟沙星）的耐藥表型。研究結(jié)果表明，256株實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)6種氟喹諾酮類藥物的總耐藥率分別為：萘啶酸(50.00％)、諾氟沙星(48.

2、83％)、氧氟沙星(48.05％)、恩諾沙星(47.66％)、環(huán)丙沙星(44.14％)和左旋氧氟沙星(40.63％)。其中，豬源菌株耐藥率為54.69％，以對(duì)諾氟沙星耐藥為主(52.14％)；人源菌株耐藥率為60.86％，以對(duì)萘啶酸耐藥為主(64.13％)；野生動(dòng)物源菌株雖然對(duì)6種氟喹諾酮類藥物相對(duì)敏感，但仍然檢測(cè)出低水平的耐藥性，耐藥率為12.50％，以對(duì)諾氟沙星耐藥為主(8.33％)。
　　 本研究選擇PMQR（質(zhì)粒介導(dǎo)氟喹

3、諾酮類耐藥）基因qnrB、qnrS和qnrD為本次三重PCR檢測(cè)方法建立的目的基因，并在確定單基因PCR擴(kuò)增體系各個(gè)參數(shù)的最佳值和可變動(dòng)范圍的基礎(chǔ)上進(jìn)行目的基因三重PCR擴(kuò)增體系的建立與優(yōu)化，其中包括模板制備、Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq酶濃度、引物濃度等、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化，得出三重PCR最佳反應(yīng)體系：10×PCRBuffer2.5μl,MgCl2(25mmol/L)3μ1,dNTP(2.5mmol/L)3.5

4、μl，模板2.5μ1(菌液濃度相當(dāng)于McFarlandNo1.0),TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)0.35μ1，上下游引物(25mmol/L)各添加：qnrB(0.9μl)、qnrS(0.6μl)、qnrD(0.5μl)，最后補(bǔ)充滅菌去離子至25μl。最佳擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min,94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。4℃保存。運(yùn)用建立的大腸桿菌PMQR基因

5、三重PCR方法檢測(cè)256株豬源、人源及野生動(dòng)物源大腸桿菌中的PMQR基因(qnrB、qnrS和qnrD),同時(shí)采用單一PCR方法檢測(cè)qnrA、aac(6′)-Ib-cr和qepA基因。結(jié)果表明：檢出率田高到低依次為aac(6′)-Ib-cr(59.38％)、qnrD(30.47％)、qnrA(30.47％)、qepA(25.00％)、qnrS(20.70％)、qnrB(19.53％)。豬源菌株中aac(6二)-Ib-cr和qnrD檢出率

6、高，分別為69.29％和43.57％。aac(6′)-Ib-cr和qnrS在人源菌株中分布較普遍，檢出率分別為54.35％和37.00％。qnrB、qepA和aac(6′)-Ib-cr均在野生動(dòng)物源菌株中有一定檢出率，其中，aac(6′)-Ib-cr基因分布較普遍，檢出率為20.83％。qnrA、qnrS和qnrD基因未在野生動(dòng)物源菌株中檢測(cè)到。
　　 本研究對(duì)6種PMQR基因qnrB、qnrS、qnrD、qnrA、aac(6′