喹乙醇耐藥基因oqxAB在不同源大腸桿菌中的流行特性與基因定位.pdf

1、喹乙醇是一種喹噁啉-N1，N4-二.氧化物，作為動物生長促進(jìn)劑而被廣泛使用，曾被認(rèn)為是一種相對安全的抗生素。隨著該藥物在養(yǎng)殖業(yè)中的長期使用，其耐藥問題也逐步被認(rèn)識。2003年從丹麥豬糞中分離出一株大腸桿菌，含有介導(dǎo)喹乙醇耐藥的接合型質(zhì)粒pOLA52。次年研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pOLA52攜帶外排泵基因oqxAB，不僅介導(dǎo)喹乙醇耐藥，還能降低細(xì)菌對氯霉素、喹諾酮類藥物的敏感性。因此，2009年oqxAB基因也被歸為一種質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥(P

2、lasmid-mediated quinolone resistance，PMQR)基因。目前關(guān)于oqxAB基因的流行病學(xué)和耐藥機(jī)理的報(bào)道較少，研究數(shù)據(jù)相對匱乏。
　　為了解喹乙醇耐藥基因oqxAB在我國大腸桿菌分離株中的流行特性及其基因定位。本研究通過測定分離株對喹噁啉類藥物（乙酰甲喹和喹乙醇）的最低抑菌濃度，設(shè)定耐藥臨界值，分析基因型和耐藥表型的相關(guān)性，了解不同來源菌株的耐藥情況;通過質(zhì)粒接合試驗(yàn)獲得oqxAB陽性接合子，對供

3、體菌、受體菌及接合子進(jìn)行喹噁啉類（乙酰甲喹、喹乙醇）、β-內(nèi)酰胺類（氨芐西林）、氨基糖苷類（慶大霉素）、喹諾酮類（萘啶酸）、苯丙醇類（氯霉素）、四環(huán)素類（四環(huán)素）藥物的敏感性試驗(yàn)，測定oqxAB對各種藥物MIC的影響及與其共轉(zhuǎn)移的耐藥基因;調(diào)查近兩年oqxAB基因在我國大腸桿菌中的流行和分布情況;定位oqxAB基因在大腸桿菌染色體還是質(zhì)粒上;測定oqxAB基因及其兩翼序列，了解oqxAB基因的結(jié)構(gòu)特征。
　　1.不同源大腸桿菌分離

4、株耐藥基因oqxAB的流行特性
　　通過測定1017株大腸桿菌對乙酰甲喹和喹乙醇的MIC值，對乙酰甲喹和喹乙醇MIC≥128μg/mL的菌株都為oqxAB基因陽性，分離株對乙酰甲喹、喹乙醇MIC值為64μg/mL時(shí)，oqxAB基因陽性菌株比例（95.4％和76.8％）顯著高于陰性菌株（4.6％和23.2％）。oqxAB基因陽性菌株對乙酰甲喹、喹乙醇MIC50(64μg/mL，64μg/mL)高于oqxAB陰性菌株對乙酰甲喹、喹乙醇

5、MIC50(4μg/mL，16μg/mL)。當(dāng)MIC≥64μg/mL的情況下，oqxAB基因陽性菌株數(shù)顯著多于陰性菌株數(shù)。設(shè)定乙酰甲喹和喹乙醇MIC≥64μg/mL為耐藥，MIC=32μg/mL為中介，MIC≤16μg/mL為敏感。在1993年至2010年1017株不同源大腸桿菌中，92.4％和99.1％的oqxAB基因陽性菌株分別對乙酰甲喹和喹乙醇耐藥或者中介。99.4％和95.2％的oqxAB基因陰性菌株分別對乙酰甲喹和喹乙醇敏感或

6、者中介?；蛐团c耐藥表型基本一致。在1017株大腸桿菌中，豬源分離株對乙酰甲喹和喹乙醇耐藥率最高（33.3％和41.5％），其次為雞源和環(huán)境源分離株，人源株(2.6％，8/306)也出現(xiàn)了一定程度耐藥。腸道內(nèi)分離株對乙酰甲喹和喹乙醇的耐藥率（16.8％和23.2％）高于腸道外分離株（11.2％和13.9％），而環(huán)境源分離株對喹乙醇的耐藥率最高(36.4％)。
　　對210株oqxAB基因陽性菌株進(jìn)行質(zhì)粒接合試驗(yàn)，共獲得35株oqx

7、AB陽性接合子。33株(94.3％)接合子對乙酰甲喹和喹乙醇耐藥，其余2株MIC都為中介值32μg/mL;分別有68.6％(24/35)、85.7％(30/35)、74.3％(26/35)、65.7％(23/35)和71.4％(25/35)的氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、萘啶酸和慶大霉素耐藥基因與oqxAB基因共同轉(zhuǎn)移。oqxAB基因可以介導(dǎo)菌株對乙酰甲喹和喹乙醇的耐藥性，不同程度降低細(xì)菌對氯霉素和萘啶酸的敏感性，與受體菌相比，接合子MIC

8、值分別升高4-256和2-128倍。
　　在2011-2012年分離自不同來源的150株大腸桿菌中，PMQR基因的陽性率為39.3％(59/150)，其中oqxAB基因的陽性率為35.3％(53/150)，顯著高于qnrB(0.7％)、qnrS(7.3％)和qepA(1.3％)。豬源分離株中oqxAB基因陽性率(63.6％，7/11)高于雞源分離株(40％，48/120)，并首次在鴿源菌株中檢測到oqxAB基因。通過分析本實(shí)驗(yàn)室前

9、期研究結(jié)果，在1993-2010年1022株大腸桿菌中，每三年的檢出率分別為12.9％、14.3％、19.6％、41.6％、20.5％和14.1％，平均陽性率為20.2％，低于2011-2012年的陽性率35.3％;oqxAB基因檢出率最高的年份為2002-2004年(41.6％)。
　　2.不同源大腸桿菌分離株耐藥基因oqxAB的基因定位
　　通過S1-PFGE及Southern雜交定位35株接合子及其供體菌、26株接合未

10、成功分離株oqxAB基因位于染色體還是質(zhì)粒上。35株接合子及其供體菌攜帶oqxAB基因質(zhì)粒的大小為40-360 kb，其中34株供體菌oqxAB基因僅位于質(zhì)粒上，另1株供體菌同時(shí)在染色體和質(zhì)粒上存在oqxAB基因，且同時(shí)位于兩個(gè)大小不同的質(zhì)粒(310 kb、350kb)。26株接合未成功的野生菌株中，25株攜帶oqxAB基因質(zhì)粒的大小為43-310kb，另1株oqxAB僅位于染色體。大腸桿菌中oqxAB基因主要位于質(zhì)粒上。
　　通

11、過對兩株大腸桿菌oqxAB及其兩翼序列進(jìn)行測序，與大腸桿菌質(zhì)粒pOLA52序列同源性為100％，oqxAB兩翼為IS26，與肺炎克雷伯桿菌MGH78578、NTUH-K2044、342染色體序列同源性為96％-99％。在GenBank登陸的17個(gè)大腸桿菌oqxAB序列（登錄號:JX412478、JX469117、JX442218、JX429863、JX294475、JF912901、HQ674771、HQ674770、AB601773、

12、AB601772、AB601771、AB601770、GQ497565、GQ120634、EU370913、JF912902、GU477622)中，其序列同源性為99％-100％，其中4個(gè)oqxAB序列(登錄號:JX469117、JX429863、EU370913、GU477622)測定兩翼序列都為IS26。通過序列分析可知，oqxAB及其兩翼IS26序列主要構(gòu)成了一個(gè)復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn6010，且該復(fù)合轉(zhuǎn)座子可能是從肺炎克雷伯桿菌染色體上