siRNA分子干擾銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵MexB基因表達(dá)的效應(yīng)研究.pdf

1、目的: MexAB-OprM外排泵系統(tǒng)在銅綠假單胞菌多重耐藥中起著重要的作用,本研究旨在探討 RNA分子干擾銅綠假單胞菌 MexAB-OprM外排泵 MexB基因效應(yīng)的研究;觀察銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)野生株和MexAB-OprM外排泵變異菌株對(duì)小鼠致病性的差異。
　　方法:設(shè)計(jì)并合成2條21bp小分子干擾RNA( small interfering RNA, siRNA)序列,構(gòu)建干擾R

2、NA表達(dá)載體,將帶有siRNA質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入PAO1。應(yīng)用E-test方法檢測(cè)PAO1抗生素MIC的變化;RT-PCR檢測(cè)MexB的mRNA的表達(dá)變化。建立銅綠假單胞菌小鼠肺部感染的模型觀察siRNA干擾MexB基因的效應(yīng),分別于感染后1d,2d和3d給小鼠腹腔注射美羅培南(meropenem100mg/kg,2次/d)。觀察各組小鼠肺大體和鏡下病理改變情況,細(xì)菌計(jì)數(shù),檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白介素-1b(IL-1b)和白介素-1

3、2(IL一12)表達(dá)水平,并檢測(cè)肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)表達(dá)水平。同時(shí)建立銅綠假單胞菌野生株K767,銅綠假單胞菌變異株nalB和△mexB小鼠肺部感染模型,并于感染后1,2和3d應(yīng)用美羅培南(meropenem100mg/kg,2次/d)治療小鼠,治療后第3d,7d,14d進(jìn)行各組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)觀察。
　　結(jié)果: MIC結(jié)果顯示siRNA能明顯提高PAO1對(duì)抗生素的敏感性。RT-PCR結(jié)果顯示siRNA干擾后的PAO1MexB

4、基因表達(dá)明顯下降(p<0.05)。siRNA干擾組小鼠,感染后3d,5d,7d肺部細(xì)菌負(fù)荷明顯下降。相對(duì)于siRNAnon(PAO1)組和Scrambled siRNA(陰性分子對(duì)照)組, siRNA組小鼠具有明顯減輕的病理學(xué)改變。在感染早期(3d)siRNA干擾組,中性粒細(xì)胞的募集(MPO)和炎性細(xì)胞因子(IL-1b和IL-12)升高,在感染后期(7d)表達(dá)水平下降。MexAB-OprM外排泵變異小鼠感染模型的結(jié)果顯示,相比于K767

5、和nalB組,在感染早期(3d),△mexB組中性粒細(xì)胞的募集(MPO)升高,在感染后期(14d)炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平下降。各組血清巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2(MIP-2)的水平在感染期間均持續(xù)升高,△mexB組與K767和nalB組相比,組間差異顯著,p<0.05。△mexB組細(xì)菌載量在感染后7,14d下降明顯,同時(shí)△mexB組具有明顯減輕的病理學(xué)改變。與K767和nalB組相比,在感染早期(3d),△mexB組中性粒細(xì)胞的募集(MPO)和

6、炎性細(xì)胞因子(IL-1b, IL-12和TNF-a)水平明顯升高,在感染后期(14d), MPO和細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯下降。三組血清巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2(MIP-2)的水平在感染期間均持續(xù)升高,△mexB組與K767和nalB組相比,組間差異顯著,p<0.05。
　　結(jié)論:siRNA可以同時(shí)抑制MexAB-OprM外排泵MexB基因的表達(dá)和銅綠假單胞菌在體外的活動(dòng)。體內(nèi)研究顯示,siRNA能有效減少小鼠慢性肺部感染的細(xì)菌載量,以M

7、exB為靶基因設(shè)計(jì)的siRNA分子為治療銅綠假單胞菌慢性感染的提供新方法。本研究為慢性銅綠假單胞菌肺部感染的治療提供了新的思路。此外,MexAB-OprM外排泵缺陷菌株△mexB組的肺部病變明顯輕于nalB組,表明MexAB-OprM外排泵系統(tǒng)在銅綠假單胞菌慢性肺部感染發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 siRNA干擾銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵mexB基因表達(dá)的體外研究<

8、br>　　目的:探討siRNA分子對(duì)銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵mexB基因表達(dá)及有關(guān)功能的影響。
　　方法:針對(duì)MexB基因設(shè)計(jì)并合成2條小分子干擾RNA( small interfering RNA, siRNA)序列,將帶有siRNA質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入PAO1。應(yīng)用E-test方法檢測(cè)PAO1抗生素MIC的變化。半定量RT-PCR和定量PCR方法檢測(cè)mexB的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:經(jīng)酶切鑒定siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功

9、,siRNA能明顯提高PAO1對(duì)抗生素的敏感性,RT-PCR結(jié)果顯示干擾后的PAO1mexB基因表達(dá)明顯下降(p<0.05)。
　　結(jié)論: siRNA成功干擾MexAMexB-OprM外排泵MexB基因的表達(dá),提高銅綠假單胞菌對(duì)抗生素的敏感性,本研究顯示采用RNA干擾方法為臨床上治療耐藥菌引起感染提供新的思路。
　　第二部分 siRNA干擾銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵MexB基因表達(dá)的體內(nèi)研究
　　目的:探討

10、siRNA分子對(duì)銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵mexB基因表達(dá)及有關(guān)功能的體內(nèi)研究。
　　方法:建立銅綠假單胞菌小鼠肺部感染的模型觀察siRNA干擾MexB基因的效應(yīng),抗菌藥物美羅培南治療感染后小鼠,腹腔注射美羅培南(Meropenem,100mg/kg,2次/d)。觀察各組小鼠肺大體和鏡下病理改變情況,細(xì)菌計(jì)數(shù),ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1b和IL一12表達(dá)水平,同時(shí)檢測(cè)肺組織MPO表達(dá)水平。

11、r>　　結(jié)果:siRNA干擾組小鼠,感染后3d,5d,7d的肺部細(xì)菌負(fù)荷明顯下降。相對(duì)于siRNAnon組和Scrambled siRNA組, siRNA組小鼠具有明顯減輕的病理學(xué)改變。在感染早期(3d) siRNA干擾組,中性粒細(xì)胞的募集(MPO)和炎性細(xì)胞因子(IL-1b和IL-12)升高,在感染后期(7d)表達(dá)水平下降。
　　結(jié)論:體內(nèi)研究顯示,siRNA能有效減少小鼠慢性肺部感染的細(xì)菌載量,以 MexB為靶基因設(shè)計(jì)的siR

12、NA分子為治療銅綠假單胞菌慢性感染的提供新方法。本研究為慢性銅綠假單胞菌肺部感染的治療提供了新的思路。
　　第三部分 MexAB-OprM外排泵變異對(duì)小鼠銅綠假單胞菌慢性肺部感染中的影響
　　目的:觀察銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)野生株和MexAB-OprM外排泵變異菌株對(duì)小鼠致病性的差異,了解 MexAB-OprM外排泵基因組在銅綠假單胞菌感染致病過(guò)程中的作用。
　　方法:應(yīng)用E

13、-test方法檢測(cè)銅綠假單胞菌 K767(wild type)野生型, nalB(MexAB-OprM efflux mutant)突變型,△mexB(knockout strain)敲除型對(duì)不同抗生素 MIC值的變化。建立野生株 K767,nalB和△mexB(1×107CFU/ml)小鼠肺部感染模型,并應(yīng)用腹腔注射美羅培南(meropenem100mg/kg,2次/d)治療感染后小鼠,治療后第3d,7d,14d進(jìn)行各組小鼠肺臟病理學(xué)

14、分析,細(xì)菌學(xué),檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞因子的水平。同時(shí)檢測(cè)肺組織 MPO變化,以及血清巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2MIP-2的表達(dá)。
　　結(jié)果:E-test結(jié)果顯示,相比K767和nalB菌株,△mexB菌株對(duì)抗生素亞胺培南(IP)、帕尼培南(ETP)、美羅培南(MP)的敏感性增強(qiáng);三者對(duì)頭孢吡肟(TM)的敏感性沒(méi)有明顯差異。△mexB組小鼠感染后3d,7d,14d的肺部細(xì)菌負(fù)荷明顯下降,同時(shí)該組小鼠具有明顯減輕的肺臟病理學(xué)

15、改變。相比于K767和nalB組,在感染早期(3d)△mexB組,中性粒細(xì)胞的募集(MPO)升高,在感染后期(14d)炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平下降。各組△mexB組MIP-2的水平在感染期間均持續(xù)升高,與K767和nalB組相比,組間差異顯著,p<0.05。
　　結(jié)論:MexAB-OprM外排泵缺陷菌株△mexB組的肺部病變明顯輕于野生銅綠假單胞菌k767和外排泵變異nalB組,這表明MexAB-OprM外排泵系統(tǒng)在銅綠假單胞菌慢性肺