銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵抑制劑篩選模型的構建以及反義RNA、正向互補RNA對MexAB-OprM外排泵表達調控的研究.pdf

1、細菌的耐藥性問題日益嚴峻，尤其是多重耐藥菌的增多，以至抗細菌感染的治療變得愈加困難，原本具有良好抗菌活性的藥物失去了應有的療效。 細菌可以通過多種途徑來產(chǎn)生對抗生素的耐藥性，其中很重要的一條途徑就是通過外排泵將胞內抗生素排出，降低胞內抗生素的濃度，減弱其作用。細菌外排泵的作用，除了可直接降低抗生素胞內濃度以保護細菌外，還能提高細菌耐藥突變率。因此，尋找外排泵抑制劑，一方面可以解決由于外排泵產(chǎn)生的細菌耐藥問題，另一方面還可以降低細

2、菌耐藥突變的發(fā)生率，對于抗細菌感染的治療具有重要意義。 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是臨床上常見的一種院內感染條件致病菌，其耐藥性機理十分復雜，但是對于多種抗生素高度耐藥，主要是由于兩種機制的存在：一種是通透性很低的外膜可以阻止抗生素進入胞內；而另一種機制則是存在可以主動外排多種抗生素的多重耐藥外排泵。 在銅綠假單胞菌中，主要存在7種RND型外排泵，而在這些外排泵中，只有MexAB—Opr

3、M外排泵既為組成性表達，又能顯著影響耐藥性，因此是銅綠假單胞菌最主要的外排泵，也是通過提高細菌對抗生素敏感性以進行抗細菌感染治療的理想靶點。 在本課題中，對于外排泵抑制劑的研究采用了兩條設計路線： 第一條路線是建立MexAB—OprM外排泵抑制劑高通量篩選模型，篩選具有外排泵抑制劑活性的化合物和天然產(chǎn)物。本研究通過在多種外排泵缺陷的銅綠假單胞菌變株N150中克隆表達MexAB—OprM外排泵的方法構建了模式菌株，并通過抗

4、生素敏感性檢測、mexAB—oprM轉錄的分子水平驗證以及對已知外排泵抑制劑的敏感性檢測等方面對該模式菌株進行評價。利用該模式菌株構建了銅綠假單胞菌MexAB—OprM外排泵抑制劑篩選模型，并對化合物與微生物來源的天然產(chǎn)物進行了篩選。 第二條路線是嘗試利用RNA技術，為尋找可以使外排泵相關基因發(fā)生沉默寡核苷酸藥物奠定基礎。 反義RNA藥物的優(yōu)點是具有靶點特異性，可以特異地抑制靶基因的表達，從而實現(xiàn)對疾病的治療。因此目前針

5、對微生物感染和腫瘤等疾病的反義寡核苷酸藥物的研究已有大量報道。本研究針對mexAB—oprM操縱子設計了一系列的反義RNA，并構建了反義RNA表達載體，在相應的銅綠假單胞菌菌株K335和K854中表達反義RNA。通過反義RNA表達株對鹽酸環(huán)丙沙星敏感性的檢驗得到了不同反義RNA的作用效果，發(fā)現(xiàn)mexR和mexA基因被反義RNA沉默后能明顯影響MexAB—OprM外排泵的作用，并了解到基因上游區(qū)域以及互補區(qū)域長度對于反義RNA在銅綠假單胞

6、菌中發(fā)揮作用的重要性。摸索反義RNA的作用特點為反義寡核苷酸類外排泵抑制劑的研究奠定理論和實驗基礎。 本論文還對正向互補RNA誘導銅綠假單胞菌mexA基因特異性沉默進行探索性研究。俄國學者首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了正向互補RNA誘導基因特異性沉默的作用，并通過序列分析提出正向互補RNA參與基因調控的機制可能廣泛存在于原核生物中。如果在其他原核生物中也發(fā)現(xiàn)平行互補RNA誘導基因特異性沉默現(xiàn)象，那么，可以借鑒反義寡核苷酸藥物的研究策略，

7、開展正向互補寡核苷酸藥物的研究，這將對抗細菌藥物的研發(fā)提供新的思路。 在銅綠假單胞菌中，選擇銅綠假單胞菌mexA基因作為目的基因進行正向互補RNA誘導基因沉默的研究。通過人工設計合成了表達mexA正向互補RNA的DNA片段。構建了正向互補RNA表達載體，在銅綠假單胞菌菌株K854中表達正向互補RNA。通過藥物敏感性檢測，發(fā)現(xiàn)對于正向互補RNA表達株，數(shù)種MexAB—OprM底物抗生素的MIC均降低了1/2。通過EB轉移檢測，發(fā)現(xiàn)